C57BL/6小鼠体重增加相关靶点的验证及其向人类的转化研究

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Validation of targets linked to weight gain in C57BL/6 mice and translational aspects in humans

　　

肥胖与生物体遗传背景及其环境之间的复杂相互作用有关。小鼠模型一直是研究肥胖的重要工具，其中C57BL/6N品系因其在高脂饮食（HFD）下易于体重增加的倾向而被广泛研究。尽管如此，其易感性的遗传基础仍知之甚少。在一篇合作论文中，研究人员鉴定了雄性C57BL/6N小鼠中导致HFD诱导性肥胖易感或抵抗的11个基因中的单核苷酸多态性（SNP）变异，这些变异解释了87%的脂肪增加个体差异。令人惊讶的是，它们中的大多数在大脑外表达最高。在本研究中，研究人员进一步验证了其中一些靶点。研究人员证明，在肌肉中组织特异性抑制Nova1和Mchr1，在肝脏中抑制Nr1i3，以及在肺和肝脏中抑制Ahr，可导致对HFD诱导的肥胖或葡萄糖不耐受产生抵抗。进一步的RNAseq分析揭示，mTOR、Acox1、IL-15和eIF2a信号位于这些基因的下游，可能介导了它们对肥胖易感性的影响。重要的是，在此鉴定的11个基因中有8个的变体先前已在人类肥胖中被发现，这表明对模式系统遗传/环境相互作用的更深入理解可以为这种复杂的人类疾病提供信息。研究人员的工作证实，体脂调节可能比当前聚焦于脑-脂肪轴的模型所暗示的要复杂得多。

研究背景与科学问题

根据世界卫生组织2022年数据，全球超过25亿成年人超重，占总人口的43%。肥胖源于长期正能量平衡——热量摄入持续超过能量消耗——但这种看似简单的公式背后隐藏着涉及遗传、代谢、行为、环境和社会经济因素的极其复杂的病因学通路。有趣的是，即使在被称为“致胖”的环境中，也并非所有个体都会变得肥胖，这表明遗传在其因果关系中扮演着重要角色。例如，大规模双胞胎研究估计，遗传对用于评估肥胖的身体质量指数（BMI）变异的贡献高达85%。全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出超过900个影响体重调控的遗传位点，其中如FTO、MC4R和POMC等基因的变体被证明可调节食欲、能量消耗或脂肪生成。

小鼠是理解影响肥胖及其相关合并症的环境因素（包括饮食因素）的关键模型。不同小鼠品系在高脂饮食（HFD）喂养下表现出不同的肥胖易感性，其中C57BL/6N品系的雄性在HFD下容易增重，而BALB/c品系的雄性则被认为具有肥胖抵抗性。尽管该小鼠品系被广泛用于研究肥胖，但其对HFD喂养易感性的遗传基础却知之甚少。早期研究鉴定了一些与该品系肥胖易感性相关的数量性状位点（QTL），最近也发现了一些候选基因，包括丙酮酸脱氢酶激酶1和整合素α6基因。

在一项前期研究中，研究人员通过杂交易感（C57BL/6N）和抵抗（BALB/c）近交系小鼠的经典遗传学方法，鉴定了影响高脂喂养下体重和脂肪增加的SNP。对HFD喂养的F2代雄鼠分析显示，11个基因内的17个SNP共同解释了87%的体重增加个体差异。对这11个基因在16种组织中的表达谱分析揭示了广泛的分布，许多基因在通常与脂肪储存调控无关的组织（如睾丸、肺和脾脏）中表达，只有三个基因在下丘脑中主要表达，表明脂肪量的控制可能涉及超越经典中枢通路的分布式机制。

尽管前期研究建立了强烈的遗传关联，但这些候选基因在调控体重方面的功能作用仍不清楚。本研究旨在通过对这11个基因进行系统性功能验证，阐明其在C57BL/6N小鼠饮食诱导性体重增加中的作用。

主要关键技术方法

研究人员使用了腺相关病毒（AAV）介导的敲低技术，通过尾静脉注射将Nr1i3的短发夹RNA递送至肝脏，通过肌肉注射将Nova1的短发夹RNA递送至肌肉。对于难以直接递送AAV至肺部的Ahr基因，以及需要在肌肉中抑制的Mchr1和Ahr，研究人员采用了药理抑制剂进行干预，即腹腔注射Ahr拮抗剂CH-223191和肌肉注射Mchr1拮抗剂ATC0065。所有实验均使用雄性C57BL/6N小鼠（购自北京Charles River），在SPF级设施中单笼饲养。为评估表型，研究人员每日记录体重和摄食量，每周使用EchoMRI体成分分析仪测量脂肪和瘦体重，并在处理末期进行腹腔注射葡萄糖耐量试验（iPGTT）。为探究下游分子机制，研究人员对敲低或抑制后的目标组织进行了RNA测序（RNAseq），并结合Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析来识别潜在的下游信号通路和关键效应分子。基因和蛋白表达水平分别通过定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）进行验证。

研究结果

AAV敲低肌肉中的Nova1和肝脏中的Nr1i3减轻了HFD诱导的肥胖并改善了葡萄糖不耐受

研究发现，Nova1和Nr1i3在HFD组的肌肉和肝脏中表达显著升高。为探索组织特异性敲低这两个基因是否能调节HFD组的体重增加，研究人员进行了AAV介导的敲低实验。结果显示，与对照组相比，肌肉中Nova1敲低组（MShNova1）在HFD喂养4周后，体重、脂肪量、能量摄入均显著降低，皮下和肾周白色脂肪组织质量也显著减小，并且葡萄糖耐量得到改善（iPGTT曲线下面积AUC显著降低）。相比之下，肝脏中Nr1i3敲低组（LShNr1i3）的体重、脂肪量和食物摄入无显著变化，但葡萄糖耐量同样得到改善。RNAseq分析表明，Nova1敲低后，线粒体蛋白输入、线粒体翻译、mTOR信号通路等受到影响，进一步蛋白检测证实mTOR通路下游的pS6蛋白水平显著下降，提示pS6可能介导了Nova1对HFD诱导性肥胖的改善作用。对于Nr1i3，其特异性通路分析和差异表达基因（DEGs）富集分析提示，Acox1是其潜在下游靶点，并且Nr1i3-Acox1轴可能通过脂肪组织中的GPR120-Glut4信号改善HFD诱导的葡萄糖不耐受。

抑制肝脏和肺中的Ahr逆转了HFD诱导的体重增加

由于Ahr仅在肺中表达有差异，且难以直接向肺部递送AAV，研究人员使用Ahr拮抗剂进行腹腔注射。与对照组相比，Ahr抑制组（IP_InAhr）在3周HFD喂养后，平均体重、食物摄入、脂肪量均显著降低，所有类型的白色脂肪组织（皮下、附睾、肾周、肠系膜）大小也显著减小，但葡萄糖耐量无显著差异。RNAseq分析结合IPA通路分析发现，在肝脏中，未折叠蛋白反应、Xbp1激活伴侣基因、ATF6激活伴侣基因、内质网应激通路是最受影响的过程，且ATF6的表达在Ahr抑制组中显著升高，提示ATF6是Ahr在肝脏中的下游靶点。在肺组织中，IL-15信号通路等显著改变，Foxa2和IL-15在Ahr抑制组中均上调。进一步检测发现，皮下白色脂肪组织（SWAT）中的IL-15和PPARa表达也显著升高，表明IL-15可能是Ahr在肺中介导改善饮食诱导性肥胖的下游基因。

抑制肌肉中的Mchr1逆转了HFD诱导的体重增加

鉴于Ahr和Mchr1在HFD喂养下的肌肉中表达均显著升高，研究人员通过肌肉注射各自的拮抗剂进行抑制。结果显示，与对照组相比，Mchr1抑制组（IM_InMchr1）的平均体重、食物摄入和脂肪量均显著降低，皮下、肾周和肠系膜白色脂肪组织显著减少，但葡萄糖耐量无显著差异；而肌肉注射Ahr拮抗剂组（IM_InAhr）则未见显著表型变化。RNAseq分析及Mchr1特异性通路分析发现，IL6R在Mchr1抑制组中表达显著升高。DEGs通路富集分析显示，响应GCN2对氨基酸缺乏的反应、真核翻译延伸等通路受影响。进一步蛋白检测证实，Mchr1抑制组肌肉中的peIF2a蛋白水平显著升高，提示eIF2a是Mchr1在肌肉中的潜在下游靶信号。

与人类的相关性

研究人员查阅文献和GWAS目录，发现在鉴定的11个基因中，有8个基因（Ahr, Cyp11b2, Dpp6, Kcnn4, Mchr1, Nova1, Nlrp1a, Nr1i3）的变体已被直接证据证实与人类BMI、身体肥胖度或其他代谢性状的变异相关。此外，为探究人类GWAS衍生的BMI相关基因的更广泛组织特异性分布，研究人员分析了450个人类肥胖相关基因在小鼠15种组织中的表达模式。结果显示，在雄性小鼠中，约23.8%的基因在下丘脑中表达最高，15.8%在脑干中，同时也有相当比例的基因在外周组织（如睾丸17.1%、脾脏7.3%、肺5.3%）中表达最高。雌性小鼠呈现相似模式。这表明在小鼠中发现的关键基因的广泛表达模式可能在人类中具有更广泛的转化适用性。

讨论与结论总结

研究人员发现，在外周组织中特异性抑制Ahr、Nova1、Nr1i3和Mchr1可直接影响HFD条件下的摄食行为、体重或葡萄糖耐量。Ahr除了在代谢活跃组织（肝、脂肪）中表达，在肺中也有高表达，抑制Ahr可逆转HFD诱导的体重增加，其下游靶点在肝和肺分别为ATF6和IL-15。Nr1i3在肝脏的特异性敲低改善了HFD诱导的葡萄糖不耐受，其效应可能由Acox1介导。Mchr1在肌肉中的抑制导致了对饮食诱导性肥胖的抵抗，其下游信号涉及eIF2a。Nova1在肌肉中的缺失可部分逆转饮食诱导性肥胖表型，mTOR可能是其下游靶点。重要的是，11个基因中有8个的变体与人类肥胖或代谢性状相关联。对人类GWAS靶基因表达模式的分析显示，其在不同组织中的分布也是分散的，而非仅限于大脑。因此，研究人员得出结论，对HFD诱导性肥胖的易感性不能仅由脑-脂肪轴的改变来解释。本研究中鉴定的候选基因在多种组织中表现出独特的表达模式，包括许多传统上与肥胖无关的组织，这表明协调的器官间通讯可能在决定机体对饮食成分的体重反应中发挥关键作用。当前模型主要关注脑-脂肪轴，并辅以胃肠道、肝脏和胰腺的作用，但本研究结果表明体脂调控远比现有模型所暗示的更为复杂，这可能为药物开发开辟新的靶点策略。