规模缩减生物反应器中L-苯丙氨酸生产期间大肠杆菌蛋白质组的解析

《Metabolic Engineering》：Unraveling the proteome of Escherichia coli during L-phenylalanine production in a scale-down bioreactor

　　

在搅拌罐生物反应器（STR）与两室生物反应器（TCB）中培养一株产L-苯丙氨酸（L-Phe）的大肠杆菌（Escherichia coli），研究人员比较了两种培养条件下菌株蛋白质组谱的差异。旁路中较长的停留时间引起了更强烈的蛋白质组变化。延长的旁路停留时间使蛋白质丰度从中心代谢转向维持功能。在异质性环境条件下，应激相关蛋白增加。本研究基于先前对L-Phe生产菌株在理想混合与波动培养条件下表型群体异质性的研究，采用定量蛋白质组学（LC-MS/MS）分析三种不同生物过程条件下采集的样本，以识别与波动培养条件暴露相关的分子响应。研究揭示，长时间暴露于此类梯度会触发初始的RpoS介导的应激响应，伴随代谢向厌氧能量生成转变，并增加转运和应激适应蛋白的表达。

论文解读文章

研究背景与问题

工业生物技术中，利用微生物生产氨基酸、有机酸、酶及药物化合物等产品是核心任务。大肠杆菌（Escherichia coli）因其快速生长、全基因组已测序以及代谢工程工具的可获得性，成为生物技术领域的重要模式生物，也被广泛用于L-苯丙氨酸（L-Phe）等重要氨基酸前体的生产。L-Phe是合成药物和甜味剂的关键前体。除菌株工程外，碳源选择也显著影响过程性能，甘油作为生物柴油生产的副产物，因其低成本且在大肠杆菌中可减少乙酸溢流，正受到越来越多的关注。

然而，生物过程开发面临的一大挑战是将过程从实验室规模放大至工业规模生物反应器。由于工业反应器体积大、黏度高，混合往往不充分，导致过程状态变量（如溶解氧、底物浓度）出现空间梯度。微生物在通过这些波动的微环境时，会暴露于快速变化的条件中，这可能强烈影响其生理状态、代谢和产物形成。因此，理解微生物在蛋白质组水平上如何适应这些非均质环境条件，对于提高生物过程的稳健性和可重复性至关重要。

为在受控实验室条件下实验研究此类效应，研究人员使用规模缩减生物反应器，其中两室生物反应器（TCB）是广泛采用的实验装置。TCB将培养分为充分混合的搅拌罐生物反应器（STR）和旁路中的次级隔室（如螺旋流转化器CFI），可建立明确的流体停留时间，从而模拟大规模生物反应器中细胞反复暴露于波动氧和底物浓度的环境异质性。

尽管转录组学和代谢组学研究已推进了对全局调控网络的理解，但蛋白质组学作为连接细胞功能的最直接手段，在动态规模缩减生物反应器条件下的系统研究仍然稀缺。蛋白质组水平上微生物适应动态变化环境条件的响应机制尚不清楚。弥合这一空白，对于将生物过程中的环境异质性与潜在的调控和代谢响应联系起来至关重要。

研究内容与结论

本研究在先前工作的基础上开展，先前研究利用TCB考察了L-Phe生产大肠杆菌报告菌株在理想混合和波动培养条件下的表型群体异质性。与充分混合的STR培养相比，TCB配置下的培养表现出改变的过程性能，包括生物量形成的差异和波动条件下产物形成的延迟，但延长培养时间后最终L-Phe浓度相当。单细胞荧光分析揭示了不同的生理响应和表型群体异质性的变化，但未能揭示细胞适应异质环境的蛋白质水平机制。

本研究对先前培养过程中采集并保存的样本进行了定量蛋白质组学分析，以识别与波动培养条件暴露相关的分子响应。研究涵盖三种生物过程条件：理想混合的STR参考过程、CFI中平均流体停留时间τ=103 s的TCB（代表中等环境梯度）、以及τ=404 s的TCB（代表强环境梯度和长时间暴露于限制条件）。该生物过程为基于质粒的L-Phe生产过程，采用基因工程大肠杆菌菌株，在每个生物过程阶段采集蛋白质组样本并随后通过LC-MS/MS分析。

研究揭示，延长暴露于此类梯度会触发初始的RpoS介导的应激响应，伴随代谢向厌氧能量生成的转变，以及转运和应激适应蛋白表达的增加。旁路中较长的停留时间引起更强的蛋白质组变化，将蛋白质丰度从中心代谢转向维持功能，应激相关蛋白在异质性环境条件下增加。

关键技术与方法

本研究采用定量蛋白质组学技术，具体包括：利用LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）对蛋白样本进行分析；样本经蛋白质提取、胰蛋白酶酶解后上机检测。研究使用的菌株为大肠杆菌FUS4 (pF81_Kan) 4RP四重报告菌株，携带rpoS-mTagBFP2、rrnB-mEmerald、narGHIJ-CyOFP1和aroF-pheA^fbr-aroB-aroL-mCardinal2荧光报告基因。样本来源于三种生物过程条件：STR参考过程、τ=103 s的TCB过程及τ=404 s的TCB过程，样本在每个生物过程阶段采集。

研究结果

蛋白质组学分析揭示不同培养条件下的蛋白表达差异

研究人员对STR和两种TCB配置（τ=103 s和τ=404 s）下采集的样本进行定量蛋白质组学分析，比较了不同生物过程阶段和不同培养条件下的蛋白质表达谱，识别出在波动环境条件下差异表达的蛋白质。

旁路停留时间对蛋白质组的影响

研究发现，旁路中较长的停留时间（τ=404 s）引起了比中等停留时间（τ=103 s）更强烈的蛋白质组变化。延长旁路停留时间使蛋白质丰度从中心代谢途径转向维持功能，表明细胞在长时间暴露于限制条件下时，资源分配发生了显著调整。

应激响应与代谢转变

在异质性环境条件下，应激相关蛋白显著增加。长时间暴露于环境梯度触发了初始的RpoS介导的应激响应，同时伴随代谢向厌氧能量生成的转变，以及转运和应激适应蛋白表达的增加。这些结果表明，细胞通过激活应激响应通路和调整能量代谢策略来适应波动的环境条件。

讨论与结论

本研究的讨论部分指出，在波动环境条件下，大肠杆菌通过RpoS介导的应激响应和代谢重编程来适应环境异质性。较长的旁路停留时间导致蛋白质组从中心代谢向维持功能转移，反映了细胞在资源有限条件下优先保证生存和维持功能的策略。应激相关蛋白的增加表明细胞感知并响应环境波动，通过上调应激适应蛋白来增强其耐受性。这些发现为理解微生物在工业规模生物反应器非理想混合条件下的生理适应机制提供了蛋白质组水平的直接证据。

研究结论为：延长暴露于环境梯度触发初始的RpoS介导的应激响应，伴随代谢向厌氧能量生成的转变，以及转运和应激适应蛋白表达的增加。该研究增进了对环境波动和旁路中不同强度停留时间如何影响大肠杆菌生理状态的理解，为优化工业生物过程、提高过程稳健性和可重复性提供了重要的分子层面的理论依据。