通过ORD（Periodate-Driven Reaction）驱动的中孔演化技术在二醛纤维素微珠中实现辣根过氧化物酶的固定及四环素的转化

《International Journal of Biological Macromolecules》：Periodate-driven mesopore evolution in dialdehyde cellulose beads for horseradish peroxidase immobilization and tetracycline transformation

　　

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  过氧化氢氧化同时调节了纤维素珠中的介孔结构，并生成了醛基反应位点。
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  DACBs经过3小时的氧化处理后，孔隙的可及性和辣根过氧化物酶（HRP）的固定效果得到平衡。
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  在H₂O₂/TC摩尔比为6的条件下，HRP-DACBs的去污率达到了83%以上。
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  液相色谱-质谱（LC–MS）分析了TC的转化途径，密度泛函理论（DFT）确定了电子活跃区域。

引言

多孔纤维素珠（CBs）作为酶固定的载体具有很大的潜力，因为它们具有良好的结构完整性、生物相容性，并且含有丰富的羟基，能够与生物分子相互作用[1]。其宏观颗粒形态也便于在异相生物催化过程中进行回收、清洗和重复使用[2]。然而，孔隙结构和反应位点密度都会影响酶的固定效果，因此在设计基于纤维素的生物催化剂时必须加以考虑。先前的研究表明，介孔SiO₂载体的孔隙特性会显著影响辣根过氧化物酶（HRP）的固定和催化活性，而HRP是一种依赖血红素的酶，常用于环境污染物的氧化转化，但其游离形式难以回收和再利用[3],[4]。目前尚不清楚这种关系是否也适用于多孔纤维素珠，研究这一点可能有助于指导基于纤维素的HRP固定载体的设计。

过氧化钠氧化能够选择性切断无水葡萄糖单元的C2–C3键，生成醛基，这些醛基可以通过Schiff碱反应成为酶固定的反应位点[5],[6],[7]。同时，这种氧化和环-opening过程还会改变纤维素链的组织结构和分子间相互作用[8]。因此，过氧化氧化提供了一种有效的方法，用于探讨同一纤维素载体内反应位点密度、孔隙结构与HRP固定效果之间的关系。

四环素（TC）是一种在水生环境中共存且难以消除的抗生素污染物[9],[10],[11]。虽然已经广泛研究了包括光催化在内的高级氧化工艺来去除TC，但这些方法在实际应用中可能需要额外的能量输入、催化剂回收以及转化产物的生成[12],[13]。HRP在水相条件下可以通过温和的酶促反应实现TC的转化[14]。利用纳米复合材料和基于纤维素的载体固定HRP，可以提高其操作稳定性和可重复使用性[15],[16]。密度泛函理论（DFT）计算被用来识别TC中的电子活性位点，并辅助解释液相色谱-质谱（LC–MS）分析得到的转化途径[17],[18]。这种电子活性分析有助于评估实验提出的TC转化区域在理论上的合理性。

在本研究中，我们探讨了二醛纤维素珠（DACBs）中醛基密度和介孔结构随氧化过程的变化如何影响HRP的固定效果。通过比较不同氧化时间制备的DACBs，分析了这些载体特性与HRP固定性能之间的关系。随后对制备的HRP-DACBs进行了酶活性、稳定性、可重复使用性和TC转化能力的评估。液相色谱-质谱（LC–MS）用于检测转化产物并提出可能的转化途径，而密度泛函理论（DFT）计算则有助于解释TC在氧化过程中的氧化和自由基作用区域。

章节片段

化学品和材料

所用纤维素（α-纤维素含量大于95%）来自湖北化学纤维集团有限公司。纤维素的粘度平均分子量为1.25×10⁴ Da。辣根过氧化物酶（HRP，EC 1.11.1.7）购自上海桑贡生物科技有限公司。尿素（CH₄N₂O，≥99.0%）、氢氧化钠（NaOH，≥96.0%）、磷酸盐缓冲液（20 mM，pH 3–10，PBS）、过氧化钠（NaIO₄，≥99.5%）、过氧化氢（H₂O₂，30% v/v）、4-氨基安替比林（4-AAP，>97%）和苯酚（>99%）均购自相应供应商。

扫描电子显微镜-能量色散谱（SEM–EDS）

SEM图像显示，经过过氧化氧化和随后的HRP固定后，珠子的球形结构得以保持，所有样品中的连通孔隙结构依然可见（图1）。为了评估珠子的整体大小均匀性，使用ImageJ软件分析了湿态CBs和DACBs-3.0 h的数字图像。CBs的等效圆直径（ECD）从2.02±0.18 mm（n=238个样本）减小到DACBs-3.0 h的1.69±0.10 mm（n=221个样本），减少了大约16.5%。

结论

在本研究中，通过过氧化氧化调控纤维素珠的介孔结构和醛基含量，以实现HRP的固定和TC的转化。氧化时间的延长逐渐增加了氧化程度，并改变了珠子的孔隙结构。在所有测试的载体中，DACBs-3.0 h在醛基密度和孔隙可及性之间提供了最佳平衡，制备得到的HRP-DACBs在湿态下的活性达到了2.85 U g^?1。

作者贡献声明

**刘苏成**：撰写初稿、项目管理和方法论设计；**迟照妍**：监督研究、软件开发、数据分析与整理；**罗晓刚**：稿件审阅与编辑、项目管理和资金申请。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益关系或个人关系可能会影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：51773159）和湖北省重点研发计划（项目编号：2024BAB109、2024BEB002）的支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决策或手稿撰写过程。

刘苏成|迟照妍|罗晓刚