《Food Chemistry: X》：Ultrasound-induced structural remodeling of plant proteins for high-internal-phase Pickering emulsion stabilization: A review
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超声处理时机（ultrasound timing）决定植物蛋白结构重塑与高内相Pickering乳液（high-internal-phase Pickering emulsions，HIPPEs）的稳定化效果。乳化前、直接超声乳化及乳化后超声三种处理路径产生截
超声处理时机（ultrasound timing）决定植物蛋白结构重塑与高内相Pickering乳液（high-internal-phase Pickering emulsions，HIPPEs）的稳定化效果。乳化前、直接超声乳化及乳化后超声三种处理路径产生截然不同的结果。蛋白质在油-水界面与连续相之间的分布决定HIPPEs的稳定性。最优超声条件取决于蛋白质初始状态与配方组成。工艺放大需控制声暴露条件并进行产品验证。
论文解读：超声诱导植物蛋白结构重塑用于高内相Pickering乳液稳定化
一、研究背景与问题
高内相Pickering乳液（HIPPEs）是指分散油相体积分数接近或超过常规密堆积参考值0.74的乳液体系。随着油相比例升高，液滴趋于拥挤并发生形变，水相被限制于薄液膜和通道中，材料表现出屈服应力、剪切变稀和类固体粘弹性，在脂肪替代、涂抹食品、可打印食品及亲脂性化合物递送等领域具有广阔应用前景。植物蛋白凭借其两亲性和形成多种胶体组装体的能力，成为HIPPEs稳定化的重要食品级稳定剂。然而，植物蛋白制剂中同时存在可溶性分子、分散胶体颗粒和较大不溶性聚集体，不同群体对超声的响应存在显著差异。超声可通过聚集体破碎、水合改善、疏水或带电区域暴露以及分子柔性增加等方式改变蛋白群体，但处理强度过大时也可能促进再缔合或氧化。这种异质性使超声效应的解释复杂化，因为HIPPEs稳定性的变化可能反映多个蛋白群体在界面和连续相中角色的改变。此外，现有综述多按蛋白来源、颗粒制备、改性方法、流变性质和食品应用分类总结，但对超声处理阶段如何影响蛋白重塑、界面行为及HIPPEs稳定化关注不足。因此，本研究旨在系统比较三种超声处理路径，阐明处理时机对蛋白改性和HIPPEs稳定化的影响机制。
二、研究内容与意义
研究人员系统比较了蛋白预超声、直接超声乳化和乳化后超声三种处理路径，分析超声时机如何影响植物蛋白结构重塑和HIPPEs稳定化。研究指出，蛋白预超声可在加油前单独考察超声对蛋白性质的影响，便于独立表征颗粒特性，但蛋白状态可能在冷却或储存期间继续变化。直接超声乳化将蛋白改性和液滴破碎结合于单一过程，但难以区分改善的乳液性质源于蛋白结构变化、液滴尺寸变化还是两者共同作用。乳化后超声作用于已形成的液滴和界面结构，可有效细化粗乳液或解絮凝，但当界面层已致密堆积或连续相中剩余蛋白不足时，新生成的界面可能无法被及时覆盖。研究还探讨了超声与其他改性策略（如pH偏移、加热、多糖或多酚复配、糖基化、酶处理）的联合应用，强调处理顺序的重要性。该研究为理解超声在植物蛋白HIPPEs中的稳定化机制提供了系统框架，对工艺优化和食品应用具有重要指导意义。
三、关键技术方法
研究人员主要采用以下关键技术方法：超声处理系统（包括探头式超声处理器，用于蛋白预超声、直接超声乳化和乳化后超声三种路径）；蛋白颗粒表征技术（包括动态光散射（DLS）、激光衍射、显微镜观察、纳米颗粒追踪分析、分析离心和过滤分级，用于评估颗粒尺寸、异质性和可溶/颗粒组分）；蛋白构象分析（包括内源荧光、表面疏水性、傅里叶变换红外光谱（FTIR）/圆二色谱（CD）、游离巯基/二硫键测定和溶解度测试）；胶体相互作用与润湿性评估（包括ζ-电位、接触角、界面分配和水合/沉降测试）；界面特性表征（包括动态界面张力、界面剪切和扩张流变、压缩-扩张循环、解吸或置换测试）；微观结构观察（包括共聚焦显微镜、冷冻电镜（cryo-EM）、原子力显微镜（AFM）和分离乳膏层分析）；体相流变学测试（包括应变/频率扫描、屈服应力、流动曲线、触变恢复、蠕变和大幅振荡剪切（LAOS））；稳定性与应用测试（包括储存、加热/冷却、冻融、离心、油/水释放、氧化、消化、打印和质构测试）。
四、研究结果
4.1 超声处理后植物蛋白状态变化
超声空化产生的微射流、剪切力、压力波动和颗粒碰撞可破坏大蛋白聚集体内的非共价相互作用，降低浊度和沉降，提高蛋白溶解度。但颗粒尺寸的减小不一定意味着完全解离为单个蛋白分子，超声可能仅将大聚集体破碎为较小组装体。值得注意的是，超声效果并不随处理强度单调增强。以鹰嘴豆蛋白为例，在20 kHz处理10分钟条件下，功率增至450 W时颗粒尺寸持续减小，而600 W处理反而增大颗粒尺寸并降低乳液性能。超声还可通过暴露疏水、带电和含巯基区域改变蛋白表面性质，但过度暴露可能促进蛋白-蛋白相互作用和再聚集。研究强调，应以颗粒尺寸、表面性质和柔性的综合匹配为目标，而非单纯追求最小颗粒尺寸。
4.2 超声后蛋白再缔合与稳定性
超声处理后，新暴露的蛋白区域可继续相互作用并促进再缔合，这一过程可能发生在冷却或储存期间。适度再缔合可保持颗粒内聚力并维持足够的流动性和变形能力，而过度再缔合会增加聚集体尺寸并损害界面功能性。以热处理蚕豆蛋白和豌豆蛋白为例，4%（w/v）蛋白在90°C加热2小时后于20 kHz、120 W条件下超声5-10分钟产生有利的胶体和界面性质，而20分钟处理导致部分再聚集并降低界面效率。鹰嘴豆蛋白研究同样显示，450 W处理产生最小颗粒和最高Pickering乳液稳定性，600 W则因再聚集而降低稳定性。超声与其他改性策略联合时，处理顺序成为重要变量。
4.3 界面吸附与蛋白层形成
在油-水界面，较小蛋白和颗粒通常比较大型聚集体更快到达界面，直接超声乳化可通过促进混合和液滴破碎增强蛋白向界面的输运。液滴尺寸减小会增加总界面面积，提高表面覆盖所需的蛋白量。适度疏水区域暴露可增强与油相的相互作用，而充分水合有助于吸附前维持蛋白分散。以大豆亲脂蛋白为例，pH 2.0条件下超声10分钟，350 W处理获得最优界面性质，吸附蛋白百分比约达53%，界面覆盖更均匀，冻融稳定性改善。研究还指出，吸附蛋白量应结合蛋白-油比例和总界面面积综合评估，且吸附百分比高并不一定意味着界面覆盖充分。界面层的组成分析显示，胶体蛋白颗粒和可溶性蛋白可共同贡献于界面稳定化。
4.4 未吸附蛋白与连续相结构化
未吸附至界面的蛋白保留在水相连续相中。随着油相比例升高，水相体积减小，未吸附蛋白和颗粒的浓度可能增加。分散颗粒可提高连续相粘度并减少水相排液，而较大聚集体可桥接相邻液滴。然而，蛋白聚集过度时，大絮凝体可使乳液结构更不均匀，促进局部水释放并干扰混合。连续相粘度过高也会限制乳化过程中的液滴破碎。研究强调，连续相网络可支持HIPPEs稳定性，但其贡献应与液滴界面蛋白覆盖程度综合考虑。在含其他稳定组分的体系中（如豌豆蛋白-绿豆淀粉复合物、豌豆蛋白-壳聚糖颗粒体系），粘度或网络强度的变化不能单独归因于蛋白。
4.5 配方变量对超声性能的影响
蛋白浓度和油相比例显著影响超声效果。以豌豆蛋白为例，超声-pH偏移处理（20 kHz、500 W、10分钟）在油相比例0.75条件下，蛋白浓度从1 wt%增至5 wt%时，液滴尺寸逐步减小，粘弹性增加，5 wt%产生最稳定且可打印的HIPPEs。这表明即使在相同超声条件下，配方变化也会改变乳液形成和稳定性，超声条件应与HIPPEs制备配方联合评估。
4.6 HIPPEs结构、流变与失效模式
HIPPEs流变行为反映液滴堆积、界面力学、液滴间相互作用和连续相结构化的综合贡献。多数植物蛋白HIPPEs表现出剪切变稀行为，在小振幅振荡剪切下G′>G″，表明以弹性响应为主。但较高的G′可能源于紧密液滴堆积、液滴间吸引相互作用、蛋白桥接、连续相颗粒相互作用或多糖增稠等多种结构贡献，不能直接视为蛋白界面吸附增强的证据。HIPPEs失效可源于油-水界面不稳定、连续相支撑不足或液滴网络内部破坏。不完全界面覆盖促进聚结，连续相支撑不足导致排液，过度桥接产生异质絮凝和脱水收缩，而过度刚性的界面或连续相网络可能在大变形下断裂。研究还强调，直接超声乳化可能引起局部加热和自由基形成，探针释放的金属颗粒可能促进脂质氧化，应监测初级和次级脂质氧化产物。
4.7 稳定化机制再评估与配方设计要求
常见报道结果（如较小液滴、较高表观粘度、增加G′和减缓相分离）仅表明乳液结构或稳定性变化，不能确定潜在稳定化机制。机制评估需要定位稳定组分并区分界面与连续相贡献的测量。界面主导解释要求直接证据表明蛋白或蛋白颗粒存在于油-水界面并贡献于稳定化，包括按总界面面积归一化的吸附蛋白量、界面成像、解吸测量和界面剪切或扩张流变。连续相主导解释要求直接证据表明连续相中保留的蛋白或颗粒贡献于乳液稳定性，包括未吸附蛋白浓度和颗粒尺寸、连续相流变、匹配无油对照、水迁移率测量和水相成像。耦合机制则需要界面和连续相两方面的独立证据。研究还提出，实验设计应明确超声暴露材料和处理时的配方条件，包括处理顺序、蛋白浓度、油相比例、pH、样品体积、温度历史、平衡时间和共稳定剂添加顺序。适当对照（如温度匹配对照、超声单独处理、二次处理单独处理和联合处理）有助于区分蛋白改性与液滴破碎的贡献。
五、讨论与结论
讨论部分强调，声暴露的定量报告对超声处理的比较至关重要。发生器功率和振幅百分比是设备特定设置，不能在不同系统间直接比较。应报告频率、标称和量热测量功率、比能量、探针直径、浸入深度、容器几何、样品体积、脉冲模式、占空比以及流动或搅拌条件，同时记录完整温度历史。温度监测至关重要，因为加热可独立影响蛋白解折叠、聚集和界面行为。冰浴可控制体相温度，但不能消除探针附近局部加热和强烈剪切。空间声暴露变化是放大过程中的重要考虑因素，批次探针系统产生不均匀声场。放大时，应选择能重现测量声暴露和所需蛋白或乳液性质的操作条件，直接按比例放大振幅、标称功率或处理时间不太可能实现等效处理。
研究结论可概括为：超声处理时机是决定植物蛋白结构重塑和HIPPEs稳定化的关键变量。蛋白预超声、直接超声乳化和乳化后超声三种路径产生不同的结构结果和解释限制。蛋白在界面和连续相之间的分布决定HIPPEs稳定性，最优超声条件取决于蛋白初始状态和配方组成。工艺放大需要控制声暴露条件并进行产品验证。该综述为植物蛋白HIPPEs的超声辅助制备提供了系统的机制理解和工艺优化框架，对食品工业中HIPPEs的规模化生产具有重要参考价值。
