《Food Bioscience》：Feeding systems differentially shape yak meat quality and flavor profiles on the Qinghai–Tibetan Plateau via rumen microbiota and muscle metabolomics
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摘要
牦牛肉是青藏高原藏族牧民的重要蛋白质来源。尽管为提升肉类供给，传统放牧（TG）体系正逐步向舍饲（BF）体系转变，但饲养体系与肉品质之间的关联机制仍知之甚少。研究人员将44头牦牛分为4个BF组（每组n=11），精粗比分别为15:85（BF1）、30:70（
摘要
牦牛肉是青藏高原藏族牧民的重要蛋白质来源。尽管为提升肉类供给，传统放牧（TG）体系正逐步向舍饲（BF）体系转变，但饲养体系与肉品质之间的关联机制仍知之甚少。研究人员将44头牦牛分为4个BF组（每组n=11），精粗比分别为15:85（BF1）、30:70（BF2）、45:55（BF3）和60:40（BF4），以评估生长性能与经济效益。随后，将代表BF体系的BF3组与传统放牧（TG）牦牛（n=11）进行比较。研究人员采用多组学方法研究了饲养体系对瘤胃微生物、瘤胃代谢物、肉营养组成及挥发性风味化合物的影响。BF3方案较精料比例较低的方案表现出更高的生长性能和经济效益。与TG相比，BF牦牛肉含有更高的必需氨基酸（EAA）和独特的挥发性化合物谱，而TG牦牛肉则含有更优的脂肪酸组成，具有更高的多不饱和脂肪酸（PUFA）水平。酪氨酸代谢主要与BF牦牛肉中芳香族化合物的形成相关，而丁酸代谢和硫代谢则与TG牦牛中的醛类和酮类化合物相关。BF组富集的瘤胃球菌属（Ruminococcus）与肌肉必需氨基酸以及参与肌肉酮类和醇类积累的瘤胃代谢物呈正相关。TG组富集的普雷沃氏菌属（Prevotella）、塞加特菌属（Segatella）和副普雷沃氏菌属（Paraprevotella）与谷氨酸及多种单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）呈正相关，并与参与醛类和有机硫化合物形成的瘤胃代谢物相关。本研究为牦牛生产体系提供了见解，并揭示了与肉品质性状相关的微生物-代谢关联。
一、研究背景与科学问题
牦牛（Bos grunniens）是青藏高原（QTP）特有的土著物种，是当地牧民重要的经济资源。牦牛肉因高蛋白（20–23%）、低脂肪（2–3%）含量以及富含必需氨基酸（EAA）和多不饱和脂肪酸（PUFA），尤其是n-3 PUFA而被视为高端特色肉类的潜在来源。然而，传统放牧（TG）体系正面临季节性饲草短缺、严酷环境条件及过度放牧带来的生态压力等严峻挑战。为此，不同饲喂方案的集约化舍饲（BF）体系被逐步引入，作为提升牦牛生长性能和稳定肉类供应的替代生产策略。已有研究表明，适度补充精料可显著提升牦牛生长性能并改善肉脂肪酸组成，全混合日粮（TMR）集约化育肥模式较TG体系能显著提升肉的嫩度和营养品质。
在BF体系中，日粮精粗比（C:R）是决定生长性能、饲料成本和经济回报的关键因素。在适宜范围内提高C:R水平通常可促进生长性能和肉类供应，但精料添加过量可能推高饲养成本、增加亚急性瘤胃酸中毒风险，并对肉品质产生复杂影响。同时，日粮组成可调节参与碳水化合物降解、挥发性脂肪酸产生和微生物蛋白合成的关键瘤胃微生物类群丰度，从而影响宿主代谢的营养可利用性。瘤胃微生物和代谢变化最终可能影响肌肉发育、肌内脂肪沉积及肉中风味前体物质的形成。尽管已有研究对牦牛TG与BF体系进行了比较，但整合瘤胃微生物组和肌肉代谢组以建立饲养体系与牦牛肉品质之间联系的系统性研究仍然有限。
因此，本研究旨在通过微生物-代谢物关系评估饲养体系如何影响牦牛肉品质。研究人员假设不同饲养体系（TG与BF）会改变瘤胃微生物群落结构和瘤胃代谢输出，进而影响肌肉营养沉积和挥发性风味化合物形成。为验证该假设，研究人员首先基于生长性能和经济回报确定BF育肥牦牛的最优C:R比，随后将优化后的BF方案与TG方案进行比较，评估不同饲养体系对肉品质属性（包括营养组成、脂肪酸和氨基酸谱及挥发性风味化合物）的影响，并采用宏基因组测序、UHPLC–MS/MS和HS-GC–MS技术表征瘤胃微生物、代谢物与肉品质性状之间的关联。
二、研究设计与主要技术方法
本研究在青海省果洛藏族自治州班玛县生态畜牧业技术示范 zone（33°13′N，100°29′E，平均海拔3,500 m）开展。44头3岁龄、初始体重相近（85.74 ± 1.14 kg）的健康公牦牛被随机分配到4个BF育肥组（每组n=11），精粗比分别为BF1（15:85）、BF2（30:70）、BF3（45:55）和BF4（60:40），试验期195 d（含15 d适应期和180 d正式试验）。基于生长性能和经济回报，BF3（45:55）被选定代表BF体系，与从试验点附近（约5 km）牧民家庭选取的11头3岁龄健康公牦牛（TG组，初始体重89.46 ± 3.57 kg，海拔3,549 m）进行比较，放牧期与BF试验严格同步（3月24日至8月24日，180 d）。
研究采用的主要关键技术方法包括：瘤胃液微生物DNA提取及宏基因组测序与生物信息学分析（fastp质控、Bowtie2去宿主、MEGAHIT组装、MetaGeneMark基因预测、CD-HIT去冗余、DIAMOND比对NCBI microNR数据库、QIIME 2计算α多样性指数、PCoA、ANOSIM和LEfSe分析）；UHPLC–MS/MS非靶向瘤胃代谢组学分析（XCMS峰检测与比对、NovoMetDB和HMDB数据库注释、PCA和PLS-DA分析）；肉品质与肌纤维特性分析（AOAC方法测定营养成分、H&E染色评估肌纤维特征）；HS-GC-MS挥发性风味化合物分析（NIST谱库匹配鉴定、ROAV计算）；UHPLC-MS/MS肌肉氨基酸分析（MRM模式）；GC-MS中长链脂肪酸分析。
三、研究结果
3.1 生长性能与经济可行性
日粮精料水平显著影响生长性能和经济回报。C45和C60组牦牛的末体重（FBW）、平均日增重（ADG）和增重（LWG）显著高于低精料组（P < 0.001），但C45和C60组之间无显著差异（P > 0.05）。经济分析显示，C45方案每头经济回报最高（889.5 ± 32.41元），表明45%精料水平是育肥牦牛肉生产最具成本效益的策略。
3.2 瘤胃微生物群落结构
BF和TG组的瘤胃微生物多样性和组成差异显著。BF组Shannon指数显著高于TG组（q < 0.001），加权UniFrac距离PCoA显示两组微生物群落明显分离（ANOSIM：R = 0.933，P = 0.001）。门水平上，拟杆菌门（Bacteroidota）和芽孢杆菌门（Bacillota）在两组中均占主导但相对丰度存在差异；属水平上，普雷沃氏菌属（Prevotella）和拟杆菌属（Bacteroides）为优势属且丰度不同。LEfSe分析鉴定出46个差异丰度微生物类群（LDA > 3，P < 0.05）：TG组富集普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、拟杆菌目（Bacteroidales）和月形单胞菌科（Selenomonadaceae）成员，BF组则富集毛霉菌纲（Mucoromycetes）等真核类群及颤螺旋菌科（Oscillospiraceae）成员（如瘤胃球菌属Ruminococcus）。
3.3 瘤胃代谢组学特征
非靶向代谢组学鉴定出3,772种代谢物，涵盖18个化学类别。PLS-DA显示TG和BF组瘤胃代谢谱明显分离（R2Y = 0.99，Q2Y = 0.93），共1,538种代谢物在组间显著差异（P < 0.05，VIP > 1），其中BF组上调672种、TG组上调866种。BF组显著富集核苷和核苷酸类（如GMP、5′-胞苷酸、尿苷5′-单磷酸、2′-脱氧腺苷-5′-单磷酸）及脂质类分子；TG组则富集苯环型化合物（如顺式-1,2-二羟基-1,2-二氢-7-甲基萘、磺胺哌嗪、异丁基对羟基苯甲酸酯）及有机酸及其衍生物（如组氨酰丙氨酸、斑蝥酸）。
3.4 肉食用品质
TG组背最长肌粗蛋白含量显著更高，而BF组肌内脂肪沉积更大（q < 0.001）。肉色方面，TG组亮度（L）和红度（a）显著更高（q < 0.05）。组织学和免疫荧光分析显示肌纤维结构存在显著差异：BF组快肌（糖酵解型）纤维数量和密度更高（q < 0.01），TG组慢肌（氧化型）纤维更丰富（q < 0.001）。蒸煮损失、熟肉率及其他纤维结构参数无显著差异（q > 0.05）。
3.5 肌肉氨基酸和脂肪酸谱
氨基酸谱分析显示，BF组多种EAA（Ile、Trp、His）和NEAA（Tyr）浓度显著更高，总EAA池更大，EAA/TAA比值升高（q < 0.05）；TG组仅谷氨酸（Glu）显著更高（q < 0.01）。脂肪酸组成方面，TG组总SFA、MUFA、PUFA、n-3 PUFA、n-3/n-6 PUFA比值、HFA、AI和NDFA浓度均显著更高（q < 0.05）。单个脂肪酸水平上，TG组18种脂肪酸显著更高（含C10:0、C12:0、C14:0、C16:0、C18:0等SFA，C14:1、C18:1 n-7t等MUFA，以及C18:3 n-3、C20:5 n-3、C22:5 n-3、C22:6 n-3等PUFA）；BF组仅4种脂肪酸（C22:0、C18:1 n-12t、C22:4、C22:5 n-6）显著富集（q < 0.05）。
3.6 挥发性风味化合物特征
共鉴定出164种挥发性有机化合物（VOCs），主要为醇类、醛类、酮类和酸类。ROAV ≥ 1的15种关键风味化合物包括8种醛类（壬醛、庚醛、戊醛、辛醛等）、4种醇类（1-辛烯-3-醇、乙醇、1-庚醇、1-己醇）和3种酮类（2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、1-辛烯-3-酮）。1-辛烯-3-醇（ROAV = 100）对两组牦牛肉风味影响最大。BF组中壬醛（ROAV = 10.66）为第二重要化合物，TG组中乙醇（ROAV = 20.55）排名第二。整体香气特征以甜味、青草味、果味和脂肪味为主，且BF组这些感官属性更突出。共78种差异丰度挥发性代谢物（VIP > 1，P < 0.05），其中59种上调、19种下调。1-戊烯-3-醇在TG组显著富集（P < 0.001），1-辛烯-3-醇和2,3-辛二酮在BF组显著富集（P < 0.001）。
3.7 肉挥发性风味物质代谢通路分析
KEGG通路富集分析确定了3条显著改变的代谢通路。酪氨酸代谢（BF组显著富集）：通过蛋白水解增加小肽和氨基酸，产生酚类、4-乙基苯甲醛和2-甲基苯甲醛等风味化合物。硫代谢（TG组显著富集）：与二甲基砜等含硫化合物形成相关。丁酸代谢（TG组显著富集）：通过脂肪酸水解增加游离脂肪酸、亚油酸和中长链脂肪酸，合成醛类、酮类和醇类。
3.8 瘤胃微生物、代谢组与肉品质相关化合物整合分析
随机森林模型确定4个与肉品质性状变异密切相关的关键瘤胃微生物类群：普雷沃氏菌属（Prevotella）、塞加特菌属（Segatella）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）和副普雷沃氏菌属（Paraprevotella）。相关性分析显示：BF组富集的Ruminococcus与肌肉EAA（Trp、His、Ile）和NEAA（Tyr）及PUFA（C22:4、C22:5 n-6）呈正相关；TG组富集的Prevotella、Segatella和Paraprevotella与Glu及大多数MUFA和PUFA呈正相关。共现网络分析显示，Ruminococcus与瘤胃核苷/核苷酸类代谢物（GMP、5′-胞苷酸、尿苷5′-单磷酸等）和脂质类分子正相关，这些瘤胃代谢特征与肌肉多种VOCs（2,3-辛二酮、2-庚酮、1-辛烯-3-醇、1-壬烯-3-醇等）正相关；Prevotella、Segatella和Paraprevotella与瘤胃苯环型化合物、脂质类分子和有机酸衍生物正相关，促进肌肉醇类（1-戊烯-3-醇、2-戊烯-1-醇、乙醇）和有机硫化合物（二甲基砜）的合成。
四、讨论总结与研究结论
讨论部分指出，提高日粮精料水平可显著改善育肥牦牛生长性能，但C45和C60组ADG相当且C45组经济回报更高，表明过量精料并不能带来额外生产效益。肉色方面，TG牦牛肉红度和亮度更高，可能归因于长期采食富含天然色素（如β-胡萝卜素）的牧草以及高海拔持续运动导致的氧合肌红蛋白水平升高；BF牦牛因饲喂谷物型日粮和干草且活动受限，肉色偏暗红、脂肪更白。肌纤维组成方面，BF组快肌纤维更多，TG组慢肌纤维更多，更高比例的I型纤维与更亮的红色和更好嫩度相关。
氨基酸和脂肪酸方面，BF体系与更高的蛋白质相关营养属性相关（EAA含量更高），TG体系则表现出独特的脂质特征（PUFA含量更高）。TG组PUFA/SFA = 0.62、n-6/n-3 PUFA = 1.72，更接近WHO推荐的最佳膳食建议；但两种体系均维持在推荐范围内，均能生产营养可接受的牦牛肉。风味方面，BF体系促进与更强、更复杂风味特征相关的香气活性化合物积累，TG体系则呈现更新鲜、更青绿的感官特征。酪氨酸代谢在BF组富集与芳香族氨基酸（Tyr、Trp、His）丰度更高一致，丁酸代谢和硫代谢在TG组富集与脂质衍生VOCs和有机硫化合物丰度更高一致。
研究还揭示了饲养体系通过瘤胃微生物重塑影响肉品质的层级调控网络：BF体系中Ruminococcus富集与肌肉芳香族氨基酸浓度升高相关，可能通过酪氨酸代谢促进酚类和苯甲醛类风味化合物形成；TG体系中Prevotella相关微生物-代谢模式与肌肉Glu和PUFA水平升高对应，可能通过增强硫代谢促进脂质衍生醛类（如壬醛）和二甲基砜等有机硫化合物产生。多组学整合揭示了饲养体系影响瘤胃微生物组、进而通过瘤胃代谢组和肌肉代谢谱传播，最终影响牦牛肉挥发性风味化合物形成的逐步调控级联。
研究结论：本研究揭示TG和BF体系与不同的牦牛肉品质特征相关，伴随瘤胃微生物群落、瘤胃代谢物和肌肉代谢谱的协同差异。TG牦牛表现出以更高PUFA水平为特征的独特脂肪酸谱，而BF牦牛表现出更高的必需氨基酸浓度和与风味形成相关的肌肉代谢物。多组学整合进一步揭示，瘤胃微生物组成的变异，特别是Prevotella和Ruminococcus等关键类群的变化，与肉品质性状相关的瘤胃代谢物和肌肉代谢谱差异相关联。这些发现为不同牦牛生产体系如何与肉品质相关的微生物和代谢变异相关联提供了见解，并凸显了优化饲养实践以平衡营养价值和风味特征的潜力。
