Hofmeister促液盐Na2SO4与牛血清白蛋白热变性对牛血清白蛋白–叶黄素结合、复合物稳定性及叶黄素体外生物活性的影响

《Food Chemistry》：Effects of a Hofmeister kosmotropic salt and protein thermal denaturation on bovine serum albumin–lutein binding, complex stability, and the in vitro biological activities of the carotenoid

　　

研究人员采用荧光、傅里叶变换红外（FTIR）和紫外–可见（UV–Vis）光谱，并结合体外抗氧化（ABTS和DPPH）及抗糖尿病活性测定，评估在pH 7.4、设定Na₂SO₄条件（0.01–0.05 M）及牛血清白蛋白（BSA）热变性下，BSA与叶黄素（LUT）的相互作用，以及类胡萝卜素分散和功能响应。荧光分析显示静态猝灭机制，化学计量比为1:1，结合常数数量级为10⁴ L/mol，并随温度（298–313 K）升高而增加。结合亲和力顺序为BSA–LUT < BSA(0.01M Sulfate)–LUT < BSAden–LUT < BSA(0.05M Sulfate)–LUT。热力学参数（ΔH° > 0，ΔS° > 0）表明疏水相互作用是复合物形成的主要驱动力。FTIR表明BSA发生结构重排，尤其是β-折叠（β-sheet）含量增加。Na₂SO₄（0.05 M）和热处理改善LUT分散，并增强其抗氧化和α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）抑制活性，表明调控BSA环境可改善含LUT体系的功能性能。

叶黄素（LUT，β,ε-caroteno-3,3′-diol，叶黄素类类胡萝卜素）是一种亲脂性天然类胡萝卜素，具有C40多烯链和末端羟基，可高效中和活性氧并猝灭单线态氧，在眼保护及氧化应激相关疾病预防中具有作用。人体不能合成LUT，须经膳食获得。然而，LUT水溶性极低，易发生光氧化降解，且热稳定性有限，这些理化限制会影响其在水性食品基质中的生物可及性和功能表现。蛋白–类胡萝卜素相互作用被视为改善疏水类胡萝卜素水性分散的策略。牛血清白蛋白（BSA，常用模型蛋白）结构清楚、具有明确配体结合位点、内源荧光和与人血清白蛋白（HSA）的结构同源性，已被用于研究其与LUT、β-胡萝卜素、虾青素等类胡萝卜素的结合。既往研究显示BSA–LUT主要以疏水作用结合，约1:1化学计量比，结合常数约10⁴ L/mol，且对NaCl和NaSCN等Hofmeister盐相对不敏感；但强促液盐（kosmotropic salt，增强水结构化的盐）Na₂SO₄中二价SO₄^2?及热变性是否产生不同效应尚不清楚。热变性（thermal denaturation，热处理导致蛋白构象改变）可暴露疏水残基并改变配体结合域可及性；Hofmeister序列（离子特异性效应序列）中的促液离子可改变蛋白水合和构象平衡。因此，研究人员在pH 7.4下设置天然BSA、热变性BSA（BSAden）、BSA(0.01M Sulfate)和BSA(0.05M Sulfate)四种蛋白环境，研究其对BSA–LUT结合、LUT分散及体外功能响应的影响。研究得出，BSA–LUT为静态猝灭、1:1结合，结合亲和力随温度升高而增加，且顺序为BSA–LUT < BSA(0.01M Sulfate)–LUT < BSAden–LUT < BSA(0.05M Sulfate)–LUT；热力学参数ΔH°>0、ΔS°>0、ΔG°<0表明疏水作用主导且结合为熵驱动；FTIR、表面疏水性、游离巯基和SDS-PAGE显示热变性、Na₂SO₄暴露及LUT结合伴随构象重排，但无可检测分子量谱变化；Na₂SO₄（0.05 M）和热处理改善LUT表观分散，并增强体外抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制响应。该研究建立了结构–相互作用–功能关系，为蛋白基水性食品体系包埋疏水类胡萝卜素提供分子层面信息；论文发表在《Food Chemistry》。

关键技术方法：在pH 7.4磷酸盐缓冲液中设置天然BSA、BSAden（80 °C处理10 min）、BSA(0.01M Sulfate)和BSA(0.05M Sulfate)四种蛋白环境；LUT商业样品（5% w/w，DSM Nutritional Products）经水性两相系统纯化。以荧光光谱（280 nm激发，298.15–313.15 K）解析猝灭、结合与热力学，FTIR分析二级结构，500 nm吸光度评价浊度，DPPH与ABTS评价抗氧化，α-葡萄糖苷酶抑制评价体外抗糖尿病功能，并测定表面疏水性（H₀）、游离巯基（SH）及SDS-PAGE分子量分布；数据以三平行均值和标准差表示，采用方差分析与Tukey检验。

3.1 荧光猝灭机制与结合参数：通过荧光滴定及Stern–Volmer和修正Stern–Volmer分析，LUT加入使各体系BSA荧光强度显著下降，天然BSA的λ_em-max由337 nm蓝移至334.5 nm，BSAden及含硫酸盐体系亦出现蓝移；K_SV随温度略降，估算K_q约10¹² L mol^?1 s^?1，高于扩散控制碰撞限，支持静态猝灭；n接近1，支持约1:1结合；K_b随温度升高，0.05 mol/L Na₂SO₄体系在各温度下最高，结合亲和力顺序为BSA–LUT < BSA(0.01M Sulfate)–LUT < BSAden–LUT < BSA(0.05M Sulfate)–LUT。

3.2 热力学分析：通过van’t Hoff方程及ΔG°计算，所有体系ΔG°为负，表明复合物形成自发；ΔH°>0且ΔS°>0，TΔS°为正并随温度增加，表明疏水相互作用主导且结合为熵驱动；0.05 mol/L Na₂SO₄体系具有最高ΔH°和TΔS°及更负ΔG°，与最高K_b一致；温度升高使ΔG°略更负。

3.3 FTIR光谱评价BSA构象变化：通过FTIR Amide A和Amide I带及二级结构定量，热处理使Amide A由3293移至3304 cm^?1、Amide I由1634移至1636 cm^?1，α-螺旋由约38%增至约47%，无规卷曲由约21%降至约14%；Na₂SO₄使β-折叠在0.01和0.05 mol/L分别增至约38%和约50%，α-螺旋约44–45%；LUT结合后Amide A/Amide I进一步位移，BSA(0.05M Sulfate)–LUT达1643 cm^?1，α-螺旋降低约5–10%，β-转角增至约50–60%，β-折叠约25–30%，表明构象重排而非广泛展开。

3.4 LUT和BSA-LUT复合物的浊度：通过500 nm吸光度随LUT浓度变化评价，游离LUT浊度随浓度升高而增加，含BSA体系浊度显著较低（p<0.05）；含Na₂SO₄体系浊度最低，0.05 mol/L最低，其次为BSAden–LUT，天然BSA–LUT居中；表明BSA提高LUT表观分散，且硫酸盐和热变性增强此作用，与更高K_b一致；该指标反映表观分散而非直接分子溶解度或聚集动力学。

3.5 体外抗氧化活性：通过DPPH和ABTS实验，BSA经热处理和硫酸盐处理抗氧化响应升高，0.05 mol/L Na₂SO₄时DPPH和ABTS分别达29.47%和40.71%；游离LUT为24.22%和41.66%；在40 μL/mL LUT下，BSA–LUT为18.82%和32.01%，低于游离LUT，而BSAden–LUT及硫酸盐复合物更高，BSA(0.05M Sulfate)–LUT最高，为39.19%和52.05%；结果与更高结合亲和力和更低浊度相一致，属于体外功能响应。

3.6 α-葡萄糖苷酶抑制、表面疏水性和游离巯基：通过α-葡萄糖苷酶抑制、BPB结合和Ellman试剂测定，游离LUT抑制率为41.39%，天然BSA最低；BSAden、BSA(0.01M Sulfate)、BSA(0.05M Sulfate)抑制率分别约44.47%、38.50%、42.16%；复合物中BSA(0.05M Sulfate)–LUT最高为80.85%，较天然BSA增约204%，较游离LUT增95%。H₀由天然BSA的72.28 μg/mg升至BSAden 80.05、0.01 mol/L 78.93、0.05 mol/L 84.94 μg/mg，复合后较复合前无显著变化；SH由1.33 μmol/g蛋白分别增至1.80、1.82、1.90 μmol/g蛋白，复合后进一步增加；这些结果与K_b变化并行，支持Na₂SO₄改变蛋白分子环境；α-葡萄糖苷酶抑制仅为体外功能，不证明体内抗糖尿病效应。

3.7 分子量分布（SDS-PAGE）：通过SDS-PAGE，天然BSA显示约66 kDa主带，热处理和硫酸盐处理未显示主分子量谱明显改变，LUT复合后未见新条带，表明未检测到片段化或共价稳定高分子量物种；SDS-PAGE对分子量分布不敏感于二级结构变化，需与FTIR、H₀和SH结果互补理解，支持非共价构象重排而未改变可检测分子量谱。

讨论部分总结：荧光、热力学、FTIR、浊度、抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制、H₀、SH和SDS-PAGE结果共同支持BSA–LUT体系的结构–相互作用–功能关系；改变蛋白环境主要改变结合亲和力大小，而未改变静态猝灭机制和约1:1化学计量比；Na₂SO₄和热变性伴随蛋白水合、构象平衡、疏水区域和巯基可及性变化，并与更强结合和更高表观分散相关，进而伴随更高体外抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制响应；荧光数据本身不能直接识别结合位点，Na₂SO₄效应不能完全归因于硫酸根促液特性，浊度反映表观分散，功能结果不等同于体内功效、生物利用度或加工贮藏中的化学保护。

研究结论翻译：该研究证明，BSA与LUT的相互作用受蛋白分子环境影响，该环境通过热变性和Na₂SO₄浓度增加进行实验调控。BSA荧光猝灭通过静态机制发生，源于与叶黄素以1:1化学计量比形成复合物；蛋白变性和硫酸钠存在均增强结合亲和力，尤其0.05 mol/L。热力学参数（ΔH°>0，ΔS°>0，ΔG°<0）表明疏水相互作用主导BSA–LUT复合，且结合在较高温度下热力学更有利。FTIR、表面疏水性、游离巯基和SDS-PAGE揭示与热变性、Na₂SO₄暴露和配体结合相关的构象重排及蛋白分子环境变化，未检测到分子量谱变化。这些分子变化伴随LUT表观分散增加及更高的体外抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制响应，其中含0.05 mol/L Na₂SO₄的BSA–LUT体系在研究所条件下响应最高。总体而言，结果建立结构–相互作用–功能关系，即调控BSA分子环境改变LUT结合及所得体系的理化和体外功能行为。这些发现提供分子层面信息，可能支持合理设计含蛋白体系以包埋疏水类胡萝卜素，而在真实食品基质中的验证仍是重要后续步骤。