基于序列的角质酶数据库挖掘与表征及其在芳香族酯高效合成中的应用

《Food Chemistry》：Sequence-based database mining and characterization of cutinases for efficient synthesis of aromatic esters

　　

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  通过基于序列的数据库挖掘鉴定出一种此前未被表征的角质层酶 NlCut，并将其选为实验表征对象。
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  固定化的 NlCut 能够在甲苯中高效合成乙酸苄酯，1小时内即可达到96.11%的收率。
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  该固定化生物催化剂在连续八次重复使用后仍保持80%以上的收率。

引言

芳香族酯类化合物，如乙酸苄酯（茉莉香气）、苯甲酸乙酯（果香）、肉桂酸苄酯（辛辣香气）和水杨酸异戊酯（冬青香气），是水果味和花香型食品香精的关键构建模块。除香料领域外，这些化合物在个人护理产品、医药和先进材料方面也展现出广泛的应用潜力。芳香族酯类化合物的全球市场持续增长。目前，芳香族酯的大规模生产仍主要依赖化学合成，通常需要高温高压条件、强酸和金属催化剂。此类过程往往存在区域选择性和化学选择性差、副产物生成量大、纯化步骤繁琐以及产生大量酸性废水等问题（Martínez & Maicas, 2021）。因此，开发高效且条件温和的酶催化工艺已成为绿色可持续合成的迫切需求。

角质层酶（E.C. 3.1.1.74）作为一种有前景的生物催化剂，已被应用于芳香族酯的合成。该丝氨酸水解酶属于α/β-水解酶超家族，具有经典的催化三联体Ser-His-Asp（Bhunia et al., 2018; Chen et al., 2008; Martinez et al., 1992），能够催化酯类化合物的可逆水解、酯化和酯交换反应（Yan et al., 2021）。与大多数脂肪酶不同，角质层酶的活性位点上方缺乏疏水性"盖子"覆盖，底物因此可在低浓度条件下接触亲核丝氨酸，使其天然适合非水相催化（Longhi et al., 1997; Wei et al., 2014）。此外，其宽敞的酰基结合口袋能够轻松容纳体积庞大的芳香环（Chen et al., 2013; Dong et al., 2020），而高度灵活的"摆动机色氨酸"（Trp W）则与偶联的Ser/Ile残基协同作用，调节底物结合和产物释放。角质层酶还对C4-C8短链底物表现出明显的偏好性，其催化效率优于经典脂肪酶和酯酶（Won et al., 2022）。综合以上特征，角质层酶成为短链芳香族酯绿色高效合成中可扩展的生物催化平台。

迄今为止，各种角质层酶已被用于在非水介质中催化短链脂肪酸酯的合成。例如，Dragana P. C. de Barros等人以异辛烷为反应介质，利用Fusarium solani pisi角质层酶分别获得了戊酸乙酯和己酸乙酯96%和97%的收率（de Barros et al., 2007）。除酯合成外，角质层酶近年来作为PET酶解降解的稳健生物催化剂引起了广泛关注。如Kawai等人综述所述，至少有四种嗜热角质层酶被认为是处理非晶态PET废弃物的有效PET水解酶，其热稳定性在反应速率和耐久性方面为工业应用提供了优势（Kawai et al., 2020）。与此同时，Hirata等人开发了一种负载在磁性纳米颗粒上的基因稳定化角质层酶，在PET生物回收中取得了显著效率（Hirata et al., 2025）。并行地，Numoto等人揭示了Ca²⁺调控角质层酶的结构动力学，为通过构象工程增强PET降解提供了结构基础（Numoto et al., 2024）。这些新兴应用和综合评估共同彰显了角质层酶在可持续塑料回收中日益扩展的生物技术应用潜力。然而，仍有三大瓶颈阻碍了其更广泛的应用：（i）酶库有限，几乎所有研究都集中于FsCut和TfCut，限制了新型角质层酶的发现（Duan et al., 2017）；（ii）活性口袋直接暴露于有机溶剂中，导致活性逐渐丧失（Nikolaivits et al., 2017）；（iii）当前的底物谱分析主要围绕聚酯降解或短链酯（如己酸乙酯、辛酸乙酯）展开，而对芳香族酯的系统研究很少（Chen et al., 2025; Lin et al., 2023; Parmar et al., 2025; Schell et al., 2025）。因此，迫切需要鉴定出具有更高稳定性和催化效率的新型角质层酶。

目前，新型角质层酶的挖掘主要通过两种互补策略进行：（i）从特定环境中分离微生物并进行基因组测序，然后通过基于活性的筛选（Sulaiman et al., 2012; Ueda et al., 2021）；（ii）利用序列同源性、保守结构域或活性位点特征作为查询条件，对基因组或宏基因组数据库进行大规模计算挖掘。序列同源性分析和保守特征分析为数据库挖掘提供了实用基础，而结构预测则支持对选定候选体的后续解读。鉴于NCBI数据库中大量未注释的蛋白序列仅按家族级别进行了编目，其真实的催化活性仍有待实验验证，导致初步筛选过程中假阳性率偏高。因此，早期的生物信息学流程必须纳入更精细的算法和策略，以提高新型酶基因发现的效率和可靠性。

因此，本研究以表征充分、活性高的落叶堆肥角质层酶突变体LCC^ICCG（F243I/D238C/S283C/Y127G）作为序列参考。选择该突变体是因为它是一种具有功能表征且可获得高分辨率结构（PDB ID: 6THT）的角质层酶，可为序列比对和后续结构解读提供可追溯的参考。本研究利用序列同源性、保守催化残基和系统发育定位，从NCBI数据库中鉴定出一种此前未被表征的角质层酶，命名为NlCut（GenBank登录号OIJ23941.1）。随后将相应基因在Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达，经亲和纯化至电泳均一，并进行全面的酶学表征。之后采用固定化策略增强其对有机溶剂的耐受性，使其能够在甲苯中高效催化合成芳香族酯。

章节摘要

菌株、质粒和试剂

pET-32a(+)载体和Escherichia coli BL21(DE3)由本实验室保存。PrimeSTAR? Max DNA聚合酶购自Takara（日本）；其他所有化学试剂均为分析纯。

基因挖掘与序列分析

以落叶堆肥角质层酶突变体LCC^ICCG作为探针，对NCBI-nr数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）进行PSI-BLAST检索。提取相似性在30-90%之间且长度差异不超过±20个氨基酸的候选序列，使用MEGA11-ClustalW进行比对，并在Weblogo和ESPript 3.0中进行可视化展示。

基因挖掘与序列分析

以LCC^ICCG蛋白序列作为探针，对NCBI蛋白数据库进行BLASTp检索。通过基于相似性的分层抽样共获得138条功能同源序列，长度范围为258至299个氨基酸（含信号肽）。随后，通过多序列比对和人工筛选，提取含有典型α/β水解酶保守基序GXSXG、催化三联体Ser-His-Asp以及氧阴离子洞（Y/F，

结论

本研究通过基于序列的数据库搜索鉴定出一种新型角质层酶NlCut，并将其选为代表候选体进行实验表征。经固定化策略改良后，该酶的有机溶剂稳定性显著提高，在非水介质中实现了乙酸苄酯和乙酸肉桂酯的高效催化合成，为角质层酶在芳香族酯绿色生产中的应用提供了可行的技术路线。

CRediT作者贡献声明

Mengyao Yu（于梦瑶）： 撰写——初稿、可视化、方法学、调查、形式化分析、数据管理。Hui Liang（梁辉）： 撰写——审阅与编辑、可视化、方法学、概念设计。Yingyao Chen（陈莹耀）： 指导。Canyu Zhang（张参雨）： 指导、项目管理。Guangjian Li（李光建）： 指导、项目管理。Mei Li（李梅）： 指导、项目管理。Yibing Wang（王一兵）： 指导。Yufei Cao（曹宇飞）： 撰写——审阅与编辑、资金获取、概念设计。Wenyong Lou（楼文勇）： 撰写——

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Wenyong Lou报告获得中国国家重点研发计划——干细胞与转化研究项目的资金支持。Wenyong Lou有一项专利号#202511941977.8正在华南理工大学申请中。若存在其他作者，他们声明不存在已知的利益冲突或相关的财务利益或个人关系。

致谢

本研究由国家重点研发计划（2022YFD2101400）资助。

于梦瑶|梁辉|陈莹耀|张参雨|李光建|李梅|王一兵|曹宇飞|楼文勇