《Environmental Toxicology and Pharmacology》：Chronic co-exposure to benzo[
a]pyrene and BDE-47 induces malignant transformation of human mammary epithelial cells via dysregulation of the
miR-491–5p/VPS28 axis
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•苯并[a]芘与BDE-47联合作用诱导恶性转化。•miR-491–5p表达下调，而VPS28表达上调。•miR-491–5p/VPS28轴调控污染物诱导的增殖。•联合作用表现出非线性和拮抗性效应。•VPS28可能与两种有毒物质直接相互作用。引言环境内分泌干扰物（EDCs）已
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苯并[a]芘与BDE-47联合作用诱导恶性转化。
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miR-491–5p表达下调，而VPS28表达上调。
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miR-491–5p/VPS28轴调控污染物诱导的增殖。
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联合作用表现出非线性和拮抗性效应。
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VPS28可能与两种有毒物质直接相互作用。
引言
环境内分泌干扰物（EDCs）已被证明可通过摄入、吸入或皮肤接触途径暴露后激活激素受体，从而促进恶性转化和肿瘤发展（Yakushiji等，2020）。在真实环境中，污染物很少以单一化合物形式存在，而通常以复杂混合物的形式出现。多环芳烃（PAHs）和多溴联苯醚（PBDEs）已在水、土壤、沉积物、野生动物及人体脂肪组织等环境介质中被广泛检出，表明苯并[a]芘（B[a]P）和2,2′,4,4′-四溴联苯醚（BDE-47）可能同时暴露（Xie等，2017）。值得注意的是，由于B[a]P和BDE-47均具有较高的脂溶性，二者会富集于富含脂质的组织，并已在人母乳、乳腺脂肪组织和乳头抽吸液中被检出（Zhang等，2017）。这种组织趋向性，结合这两种化合物激活芳香烃受体（AhR）和雌激素受体（ER）信号通路的共同能力，使乳腺 carcinogenesis 成为特别值得关注的问题，也凸显了研究其联合效应的转化医学意义。
B[a]P是一种具有广泛环境分布的代表性多环芳烃，已被国际癌症研究机构（IARC）归类为1类致癌物（Monteiro等，2024）。尽管B[a]P本身不具有直接致癌性，但在芳香烃受体（AhR）激活后，可通过细胞色素P450（CYP450）酶代谢激活，形成致癌性中间产物（Das和Ravi，2022）。BDE-47是PBDEs的主要同系物，在环境介质中普遍存在，与多种不良健康效应相关，包括致癌作用；流行病学研究报告血清PBDE水平与乳腺癌风险之间存在正相关关系（He等，2018）。先前的研究表明，BDE-47可激活AhR信号通路并表现出雌激素样活性，从而干扰内分泌功能。值得注意的是，B[a]P和BDE-47共有的AhR激活与雌激素受体（ER）信号通路汇聚现象，提示二者对乳腺等激素敏感组织可能存在交互效应，但其对乳腺癌发生的联合影响仍有待深入研究（Kanaya等，2019）。
实验和流行病学研究均表明，B[a]P诱导的乳腺致癌过程涉及多种机制，包括DNA损伤、DNA修复障碍、雌激素受体激活以及微小RNA（miRNA）失调（Amadou等，2021，Malik等，2018，Shi等，2017）。同样，BDE-47暴露已被证明可破坏线粒体功能并诱导细胞损伤，部分通过miRNA介导的途径实现（Shan等，2019，Zhao等，2017）。这些发现表明，表观遗传调控，尤其是通过miRNA途径，可能在两种化合物的毒性效应中发挥关键作用；然而，其潜在的分子机制尚未完全阐明。
微小RNA（miRNAs）是一类小分子非编码RNA，在转录后水平调控基因表达，与肿瘤的起始和进展密切相关（Hussen等，2021，Ali Syeda等，2020）。其中，miR-491–5p已在多种癌症（包括乳腺癌）中被鉴定为肿瘤抑制因子。其在肿瘤组织中的表达显著下调，而过表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭（Guo等，2021）。此外，环境致癌物已被证明可调控miRNA表达，从而促进肿瘤发生（Li等，2020）。基于这些观察，我们假设miR-491–5p可能参与B[a]P和BDE-47诱导的致癌过程。
溶酶体蛋白分选28（VPS28）是运输所需内体分选复合体I（ESCRT-I）的关键组分，在胞内运输中发挥重要作用（Hurley和Hanson，2010）。已有报道指出VPS28可与肿瘤易感基因101（TSG101）相互作用，从而影响肿瘤相关过程（Merigliano等，2021）。我们前期的研究通过生物信息学分析和实验验证，将VPS28鉴定为miR-491–5p的潜在靶点，并发现二者表达水平之间呈显著负相关（Shi等，2021）。这些发现提示miR-491–5p/VPS28调控轴可能参与致癌过程。
与传统的单一化合物暴露研究不同，本研究在环境相关浓度下探讨B[a]P和BDE-47的联合效应。我们假设联合作用可能产生非加和性效应，且miR-491–5p/VPS28轴参与了这一过程。为验证该假设，我们建立了慢性暴露模型，评估人乳腺上皮MCF-10A细胞的恶性转化。MCF-10A是一种表征明确的非肿瘤乳腺上皮细胞系，可模拟大多数乳腺癌的细胞起源（Soule等，1990）。具体而言，我们旨在比较单一暴露和联合暴露对细胞转化的影响，表征miR-491–5p和VPS28的表达模式，并确定在联合暴露条件下它们的调控相互作用是否存在差异。本研究为混合毒性的机制提供了见解，有助于对环境致癌风险进行更真实的评估，尤其对乳腺癌具有现实意义。
章节摘要
细胞培养
人乳腺上皮MCF-10A细胞购自Punan Sai（武汉，中国）。细胞在补充有5%马血清（HS）、20 ng/mL表皮生长因子（EGF）、10 μg/mL胰岛素、0.5 μg/mL氢化可的松、1% MEM非必需氨基酸（NEAA）和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中培养。细胞在37 °C、5% CO?的湿润培养箱中维持培养。
细胞毒性
处于对数生长期的MCF-10A细胞被随机分配至未处理对照组和DMSO溶剂
B[a]P和BDE-47慢性暴露改变MCF-10A细胞形态
对第15代和第30代MCF-10A细胞进行H&E染色以评估形态学改变。与对照组相比，B[a]P处理组细胞在第15代即表现出明显的形态学变化。这些改变在BDE-47组和联合暴露组中更为显著（图1A）。在第30代，所有暴露组均显示出显著的形态学转化，表现为细胞体积增大、核深染、胞内
讨论
在真实环境中，环境污染物很少以单一物质形式出现，联合暴露场景越来越多地被认识到在毒理学评估中更具相关性。本研究建立了慢性低剂量暴露模型，以研究苯并[a]芘（B[a]P）和BDE-47对人乳腺上皮细胞的联合效应。我们的结果表明，单一和联合暴露均可诱导恶性转化相关表型，包括
CRediT作者贡献声明
唐永军：撰写—初稿、可视化、软件、方法学、调查、资金获取、形式化分析、数据整理、概念构思。马辰璐：撰写—初稿、可视化、软件、方法学、调查、资金获取、形式化分析、数据整理、概念构思。冯震宁：方法学、调查。姜念：方法学、调查。陈小龙：软件。何映旭：软件。Francis L. Martin：撰写—审阅与
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经桂林医科大学伦理委员会批准（批准号：GYLL2022086）。
资助
本研究由广西壮族自治区自然科学基金（项目编号：2023GXNSFAA026322）和广西科技计划（编号：GK LT2600640034）资助。本研究还获得了广西科技基地与人才专项（项目编号：AD18050005）的支持。
利益冲突声明
作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在的利益冲突：Peng Weiyi报告了与桂林医科大学的关系，包括：就业和资金资助。Peng Weiyi有一项专利待审。如有其他作者，他们声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本研究报告的工作。
唐永军|马辰璐|冯震宁|姜念|陈小龙|何映旭|Francis L. Martin|刘慧|庞维艺
