黄芪甲苷IV通过调控HIF-1α介导的自噬缓解腹膜透析相关腹膜纤维化

《Current Pharmaceutical Analysis》：Astragaloside IV Alleviates Peritoneal Dialysis-Related Peritoneal Fibrosis by Regulating HIF-1α-Mediated Autophagy

　　

背景： 腹膜纤维化（peritoneal fibrosis, PF）是长期腹膜透析（peritoneal dialysis, PD）的主要并发症。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）的失调破坏了自噬稳态，加速了上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）并加重了PF。本研究探讨了黄芪甲苷IV（Astragaloside IV, AS-IV）对抗PF的治疗效果及其靶向HIF-1α依赖性自噬的机制。方法： 通过网络药理学和分子对接预测AS-IV的核心靶点，随后进行体外和体内验证。应用TGF-β1刺激的HMrSV5细胞和HIF-1α过表达细胞模型，并给予AS-IV、二甲基草酰甘氨酸（dimethyloxalylglycine, DMOG）和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine, 3-MA）干预。采用蛋白质印迹法、免疫荧光、实时荧光定量PCR和透射电子显微镜检测信号通路、自噬和EMT标志物。建立了腹膜透析液联合脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的大鼠PF模型；在AS-IV或氯沙坦治疗后，对腹膜组织进行组织学和分子评估。结果： HIF1A和MTOR被确定为核心靶点。分子对接证实AS-IV与HIF-1α/mTOR蛋白之间存在稳定结合。在体外，AS-IV抑制了HIF-1α/mTOR过度激活，恢复了自噬并抑制了TGF-β1触发的EMT。DMOG或3-MA消除了AS-IV的保护功能。在体内，AS-IV减轻了腹膜病理损伤，抑制了HIF-1α/mTOR信号传导，恢复了自噬活性并阻断了EMT进展，其疗效与氯沙坦相当。结论： AS-IV通过调控HIF-1α介导的自噬缓解PD相关PF。这些为临床前研究结果，需要进一步的遗传学验证和自噬流检测以确认因果关系。

黄芪甲苷IV经HIF-1α/mTOR-自噬轴改善腹膜透析相关腹膜纤维化的机制解读

一、研究背景与科学问题

腹膜透析是终末期肾病患者的主要肾脏替代治疗方式之一，占全球肾脏替代治疗的11%–13%，具有操作简便、经济、能有效清除中分子尿毒症毒素、血流动力学平稳以及保留残余肾功能的优势。然而，长期暴露于高糖透析液、尿毒症毒素及反复腹膜炎刺激，会损害腹膜的结构与功能完整性，最终导致腹膜纤维化（PF），引起超滤失败，严重影响腹膜透析疗效。PF的核心病理特征之一是腹膜间皮细胞（PMC）丧失上皮特征、转化为肌成纤维细胞样表型，即上皮间质转化（EMT），这是PF的早期可逆病理阶段。

自噬是哺乳动物细胞应对外界应激或环境变化的自我调控机制，通过溶酶体降解受损细胞器和入侵微生物以维持细胞稳态。在生理条件下，自噬发挥细胞保护作用，缓解腹膜缺氧和高糖刺激引起的细胞应激。但在PF的慢性病理微环境中，自噬功能常发生失调，无法有效清除受损细胞成分，并与EMT进展协同加速腹膜纤维化。已有证据表明，自噬功能障碍是肝、肾、肺等多器官纤维化的核心驱动因素，自噬失调与PF发病密切相关。

HIF-1α是HIF-1异二聚体复合物的氧感应亚基，是协调细胞对低氧条件适应性反应的主要转录因子，参与糖尿病、恶性肿瘤和炎症性疾病的发病。HIF-1α与自噬的调控关系具有情境依赖性和双相性。在急性缺氧应激下，HIF-1α转录上调BNIP3/BNIP3L，使Beclin-1从Bcl-2上解离，启动细胞保护性自噬。然而，在长期PD损伤的慢性环境中，持续性假性缺氧、持续高糖刺激和促纤维化细胞因子诱导PMC中HIF-1α持续蓄积，与mTOR信号形成持续的正反馈环路，导致mTOR过度激活压倒性地抑制BNIP3介导的促自噬信号，造成自噬稳态抑制、PMC进行性EMT和腹膜纤维化重塑。研究人员推测，慢性HIF-1α/mTOR依赖性自噬抑制，而非急性BNIP3相关保护性自噬，是PD相关PF的核心病理驱动因素。

黄芪甲苷IV（AS-IV）是从黄芪中提取的主要生物活性成分，具有抗炎、免疫调节、抗纤维化等多种药理活性。既往研究已证实AS-IV通过干扰TGF-β1/Smad、EGFR、PI3K-Akt等多条信号通路减轻PF进展，并能在高糖和尿毒症微环境下通过多种调控轴恢复异常自噬。然而，AS-IV是否通过靶向HIF-1α/mTOR交互轴恢复缺陷的自噬稳态并减轻PF，尚未得到实验验证。基于网络药理学预测和分子对接验证，本研究假设AS-IV通过阻断慢性HIF-1α/mTOR过度激活、恢复自噬稳态并抑制PMC来源的EMT来改善PD相关PF。

二、研究设计与主要结论

研究人员建立了多层次实验系统，包括体外TGF-β1刺激的HMrSV5细胞模型、HIF-1α过表达及DMOG和3-MA药物拯救实验，以及体内高糖透析液联合LPS诱导的大鼠PF模型。研究结果表明，HIF-1α异常激活驱动mTORC1过度激活，破坏自噬稳态并促进EMT。AS-IV通过抑制HIF-1α/mTOR信号传导和恢复功能性自噬逆转了这些病理改变。该研究首次将HIF-1α介导的自噬确立为PF中可药用的靶点，并揭示HIF-1α介导的自噬是AS-IV治疗PF的先前未被认识的机制，为PD患者PF预防中中药活性成分的临床开发提供了机制依据。

三、关键技术方法

本研究采用多层级技术体系。首先通过网络药理学分析，利用PubChem、SwissTargetPrediction、SuperPRED数据库预测AS-IV作用靶点，从GeneCards和DisGeNet提取PF和自噬相关基因集，经Venn交集筛选出34个重叠靶基因，通过STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络，并经Cytoscape进行拓扑可视化，在Metascape平台进行GO和KEGG富集分析。分子对接采用AutoDock Vina计算AS-IV与核心靶点HIF-1α（PDB: 4H6J）和mTOR（PDB: 4DRI）的结合能，以2-ME2和雷帕霉素为阳性对照配体、甘露醇为阴性对照配体，结合构象经PyMOL可视化。体外实验采用TGF-β1刺激的人腹膜间皮细胞系HMrSV5（购自Jennio Biotech），结合HIF-1α过表达质粒转染、雷帕霉素干预及AS-IV联合DMOG或3-MA的拯救实验。体内实验采用40只雄性SD大鼠（180–200 g，由山西医科大学动物实验中心提供，批号24828），随机分为对照组、PF模型组、AS-IV组（40 mg/kg灌胃）和氯沙坦钾组（30 mg/kg灌胃），PF模型通过每日腹腔注射4.25%腹膜透析液（100 mL/kg）联合第1、3、5、7天注射LPS（0.6 mg/kg）建立，干预持续28天。检测手段包括蛋白质印迹法、RT-qPCR、免疫荧光染色、透射电子显微镜、H&E染色、Masson三色染色和免疫组织化学染色。

四、研究结果

3.1 AS-IV抗腹膜纤维化核心靶点的筛选与富集分析。 通过Venn交集分析筛选出AS-IV、自噬和PF共享的34个重叠靶基因。PPI网络拓扑分析确定HIF1A和MTOR为连接度最高的两个核心枢纽基因。GO富集结果显示AS-IV参与自噬调控、细胞迁移和凋亡调节等生物学过程，分子功能主要富集于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和转录辅因子结合。KEGG富集分析发现多条细胞内信号轴的丰富富集，特别是HIF-1和mTOR通路。

3.2 AS-IV与核心靶点结合亲和力的分子对接验证。 分子对接模拟显示AS-IV与HIF-1α的结合自由能为?7.4 kcal/mol（估计Ki = 3.77 μM），与THR-361、ASN-463和VAL-464形成氢键；与mTOR的结合能为?7.7 kcal/mol（估计Ki = 2.27 μM），与GLU-2032和TYR-2105形成氢键。AS-IV的结合亲和力显著高于阴性对照甘露醇，与阳性参照配体相当，表明AS-IV可直接靶向HIF-1α和mTOR。

3.3 HIF-1α过表达对HMrSV5细胞mTOR通路活性、自噬和EMT的影响。 TGF-β1刺激上调HIF-1α、p-mTOR和p-S6K1蛋白表达；HIF-1α过表达进一步增强mTOR通路激活；雷帕霉素处理逆转了HIF-1α过表达诱导的mTOR通路过度激活。HIF-1α过表达降低Beclin-1的mRNA和蛋白水平、降低LC3-II/I比值并诱导p62蛋白蓄积，透射电镜证实自噬体和自溶酶体数量减少且自噬形态受损；雷帕霉素恢复了HIF-1α过表达细胞的自噬活性。HIF-1α过表达显著升高FN、Col-1和α-SMA的表达，加重TGF-β1触发的EMT；雷帕霉素干预减弱了HIF-1α过表达驱动的EMT。这些细胞数据表明HIF-1α过表达通过激活mTOR通路、抑制细胞自噬和促进EMT促进纤维化进展。

3.4 AS-IV抑制HMrSV5细胞中异常的HIF-1α/mTOR信号激活。 免疫荧光染色显示AS-IV显著逆转TGF-β1诱导的HIF-1α表达上调；蛋白质印迹法证实AS-IV显著降低HIF-1α、p-mTOR和p-S6K1的蛋白表达。DMOG或3-MA预处理显著消除了AS-IV对mTOR通路激活的抑制作用，证实AS-IV有效减弱HMrSV5细胞中HIF-1α/mTOR过度激活。

3.5 AS-IV通过恢复自噬抑制HMrSV5细胞EMT。 AS-IV上调Beclin-1表达和LC3-II/I比值、减少p62聚集并增加自噬体和自溶酶体数量，恢复受损的自噬。DMOG和3-MA预处理均消除了AS-IV的促自噬作用。AS-IV下调FN、Col-1和α-SMA的mRNA和蛋白水平以缓解EMT进展，DMOG或3-MA显著减弱了AS-IV的抗EMT疗效。结果表明AS-IV通过抑制HIF-1α/mTOR信号传导和恢复自噬稳态来抑制EMT。

3.6 AS-IV改善大鼠腹膜组织病理纤维化病变。 H&E染色显示PF大鼠腹膜组织结构紊乱、间皮下基质增厚伴炎症浸润，AS-IV治疗改善组织形态紊乱并减少炎症浸润。Masson三色染色显示PF模型组胶原沉积广泛，AS-IV干预降低胶原纤维面积分数。免疫组织化学检测证实PF组Col-1表达显著上调，AS-IV有效下调Col-1表达并减少腹膜组织细胞外基质蓄积。AS-IV疗效与阳性对照氯沙坦相当。

3.7 AS-IV对大鼠腹膜组织HIF-1α/mTOR信号、自噬和EMT的调控。 与对照组相比，PF模型大鼠腹膜组织中HIF-1α、p-mTOR和p-S6K1表达显著上调；AS-IV干预下调了这些蛋白的表达。PF组自噬活性受抑，Beclin-1水平和LC3-II/I比值降低、p62丰度升高；AS-IV升高Beclin-1水平和LC3-II/I比值、降低p62蛋白丰度，表明自噬活性恢复。PF模型大鼠EMT标志物在转录和翻译水平均异常上调，AS-IV显著降低其表达。阳性对照氯沙坦与AS-IV发挥相当的调节作用。

五、讨论与结论

讨论部分指出，自噬功能障碍是多器官纤维化的核心驱动因素，EMT是PF的初始可逆病理阶段并受自噬精确调控。HIF-1α是调控细胞缺氧适应的主要转录因子，PD患者腹膜微环境存在慢性损伤，触发PMC中HIF-1α持续转录。HIF-1α通过mTOR正反馈交互间接抑制自噬：持续HIF-1α升高增强PI3K/Akt介导的mTOR磷酸化，激活的mTOR通过STAT3和O-GlcNAc转移酶依赖性翻译后修饰稳定HIF-1α，形成自我放大的病理正反馈环路。此外，HIF-1α驱动的糖酵解重编程导致乳酸蓄积、损害溶酶体功能，从自噬体生物发生的起始阶段和自噬体降解的终末阶段双重阻断自噬稳态。HIF-1α对自噬的调控高度依赖于刺激持续时间、HIF-1α表达水平和下游mTOR活性，慢性HIF-1α激活消除了早期自噬保护并加重炎症组织损伤。AS-IV通过阻断HIF-1α/mTOR病理反馈环路恢复自噬稳态发挥治疗作用，拯救实验表明AS-IV的保护活性需要同时依赖HIF-1α/mTOR抑制和自噬稳态恢复。

研究结论为：本研究证明HIF-1α介导的自噬功能障碍驱动PD相关PF进展，AS-IV通过抑制HIF-1α/mTOR恢复自噬稳态减轻纤维化损伤。这些发现为以AS-IV为代表的中药活性成分作为PD患者PF预防辅助治疗的临床开发提供了机制依据。