一种表征胶质母细胞瘤微环境中免疫细胞迁移的实验-计算框架

《Computer Methods and Programs in Biomedicine》：An experimental-computational framework to characterize immune cell migration in the glioblastoma microenvironment

　　

摘要

背景与目的：胶质母细胞瘤进展的主要生理驱动因素之一是免疫系统与肿瘤微环境的相互作用。在此过程中，分泌的趋化因子建立生化梯度，引导免疫细胞的迁移与浸润。理解这些信号如何调节免疫细胞运动能力，对于表征免疫激活与抑制的机制至关重要。此外，这种趋化反应显著受到细胞外基质力学性质的调节。

方法：本研究提出了一套集成化流程，将体外微流控实验与基于主体的模型（ABM）相结合，以表征在两种胶原浓度（2和4 mg/mL）下的外周血单个核细胞迁移动力学。该流程包含一个参数化模型，其参数通过感兴趣的特定量从实验数据中进行校准。校准过程本身首先在虚拟（in silico）实验中进行验证，在这些实验中生成了具有已知参数值的合成数据，并要求流程能够恢复这些参数。

结果：结果表明，较高的胶原浓度与定向迁移显著降低相关。虽然这一结果可归因于物理效应，即更密集的细胞外基质在机械上限制了细胞位移，但结果更符合化学感受机制，即基质密度的增加降低了趋化因子的扩散，从而损害了免疫细胞沿化学梯度定向的能力。此外，还观察到运动指标及其相关参数的时间衰减，在较低胶原浓度下达到统计显著性，这可能反映了渐进性免疫耗竭，与先前的报告一致。

结论：综合这些发现，细胞外基质密度和时间动态共同调节了本胶质母细胞瘤模型中免疫细胞的迁移。所提出的框架能够对免疫细胞迁移进行机制性解释，从而补充传统的统计分析，提供了一个可适应其他细胞群体和肿瘤情境的通用平台。

引言

细胞迁移是由机械和化学信号协调的过程，在癌症中决定了肿瘤的侵袭能力和免疫反应的有效性。虽然肿瘤细胞迁移促进转移，但免疫系统细胞的协同浸润是当前免疫治疗成功的决定因素之一。对实体瘤免疫浸润的定量表征有助于预测患者预后和优化治疗策略。

多种数学和计算模型已被用于描述细胞迁移，从基于偏微分方程的连续介质方法到追踪单个细胞的离散模型。基于主体的模型（ABMs）日益受到重视，因为它们将单个细胞表示为自主实体，能够感知并响应局部环境信号，如趋化因子梯度、细胞间相互作用和细胞外基质异质性。这种描述层次在今天的高计算能力下得以实现，使复杂群体行为从简单的单细胞规则中涌现，并为连接实验观察与机制性假设提供了自然框架。在肿瘤生物学和免疫肿瘤学中，ABMs已被用于研究肿瘤侵袭、免疫细胞浸润和不同微环境情景下的治疗反应。然而，许多现有模型依赖于简化的或现象学的运动描述，未直接针对三维环境中获得的定量测量进行校准，这限制了它们在复杂体内条件下外推时的预测能力。在ABMs的背景下，校准步骤至关重要，因为这些模型通常包含大量参数。它们各自的特性和内在随机性使该步骤特别具有挑战性：每个参数集都需要重复模拟以表征模型输出的分布，这使得穷尽性探索参数空间（计算上不可行）变得困难，并复杂化了标准估计技术的使用。运动模型即为典型例子。持续随机游走及其相关的速度跳跃过程长期以来被用于描述细胞轨迹，其输运性质为经典结果；然而，实际上从微流控实验中可获得的统计量是从有限数量跟踪细胞计算的群体描述符，其关系很少被明确表述。在闭合形式下建立该关系是校准问题的关键，而不仅仅是数值求解。

胶质母细胞瘤是最具侵袭性的脑肿瘤之一，中位生存期仅为8个月，呈现双重免疫景观：虽然某些免疫细胞亚群发挥抗肿瘤活性，但肿瘤微环境通常通过细胞耗竭、局部抑制和招募免疫抑制性群体等机制促进免疫耐受。胶质母细胞瘤分泌多种趋化因子，包括CCL2、CXCL12、CXCL10和IL-6，调节外周血单个核细胞、小胶质细胞和其他免疫效应细胞的迁移。胶质母细胞瘤基质以胶原、纤连蛋白和蛋白聚糖的密集沉积为特征，进一步限制了细胞因子扩散并损害免疫细胞浸润。简言之，胶质母细胞瘤呈现了丰富而复杂的肿瘤微环境，传统体外模型难以复制。幸运的是，微流控设备通过实现对三维微环境的精确控制、细胞动力学的实时定量以及生理相关细胞外基质环境中定义化学梯度的生成，革新了细胞迁移的研究。因此，微流控平台非常适合定量剖析胶质母细胞瘤细胞外基质结构和趋化因子梯度如何共同调控免疫细胞的迁移行为。

利用微流控平台的高通量来驱动数学模型，在本研究中，我们将微流控实验与基于主体的模型相结合，以回答关于胶质母细胞瘤U-251 MG细胞系三维构型肿瘤微环境中外周血单个核细胞迁移的三个问题。首先，胶原浓度是否改变外周血单个核细胞的运动能力，以及对定向和总运动能力的影响程度是否相同？其次，运动能力是否在实验第一天和第二天之间发生变化？第三，这些观察是否能通过具有少量可解释参数的基于主体的模型复现，且这些参数是否能从可用数据中识别？为此，我们采用双因素设计，将两种胶原浓度（2和4 mg/mL）与两个时间点（第0天和第1天）相结合。

本研究存在一些局限性。趋化性建模不在本文范围之内，因此假设细胞经历恒定偏差，其方向朝向胶质母细胞瘤区室，可从装置几何形状得知。同样，水凝胶的力学性质未被明确建模；胶原浓度仅作为实验条件进入分析，通过其对照校准运动参数的影响。开发模型而非仅将分析限制在轨迹指标的统计比较上的理由在于，净位移或曲折度等描述符是特定条件下的摘要，而模型参数具有机制性解释，它将定向和总运动能力分离，并可用于在未测试构型中生成预测。

本工作的贡献有三方面。（i）我们推导了基于主体模型感兴趣量的一阶和二阶统计量的闭合形式表达式，包括时间相关增量的情况。然后，我们利用它们表征损失景观的几何结构和模型参数的可识别性，特别是展示所选择统计量能够和不能确定哪些参数组合。（ii）我们提出了基于这些感兴趣量的校准流程，并通过具有已知参数值的虚拟实验进行验证。（iii）我们将该流程应用于胶质母细胞瘤微流控模型中外周血单个核细胞迁移的实验数据集，展示了校准参数如何补充传统统计分析。该框架并非特定于此系统，可轻松适应其他细胞群体和肿瘤情境。

方法

本节详细介绍了用于表征胶质母细胞瘤肿瘤微环境中外周血单个核细胞迁移的实验和计算框架。首先，描述了用于细胞表征的体外模型。随后，概述了从实验显微镜图像中提取细胞轨迹的程序。接着，描述了开发的用于复现实验观察的基于主体的模型。然后，描述了参数校准中使用的统计感兴趣量。

验证

为了验证拟合过程，我们使用误差的分析表达式探索优化景观。此外，我们从已知参数集生成虚拟数据，以比较使用校准框架通过优化获得的结果与用于数据生成的参数。有关校准性能、不同感兴趣量及其不确定性的准确性以及噪声影响的进一步细节可在附录C中找到。

讨论

从基于主体模型优化中获得的统计指标和拟合参数提供了关于不同实验条件下外周血单个核细胞迁移行为性质的定量洞察。结果表明，较高的胶原浓度与定向迁移降低相关。轨迹指标的统计分析支持了这一效应，即第0天净位移和vx的降低，而校准参数表明定向运动能力在两种胶原浓度下均减弱，且在更高胶原浓度下更为明显。运动参数c和Tpers在Day 1较Day 0下降，表明运动能力随时间衰减，这可能与免疫耗竭一致。

总结与结论

本研究提出了一套集成化流程，将体外微流控实验与基于主体的模型相结合，以表征肿瘤模拟系统中外周血单个核细胞迁移动力学，重点关注胶原浓度和时间变化的调节作用。为使集成化流程可靠，我们使用已知潜在参数的虚拟生成数据集验证了该方法。为此场景，我们推导了不同感兴趣量的闭合形式表达式，用于校准过程。

作者贡献声明

Raquel B. Arroyo-Vázquez：撰写初稿、验证、软件、方法、调查、形式分析、数据整理。Guillermo Mora-Ruiz：撰写初稿、可视化、调查。Marina Pérez-Aliacar：撰写初稿、可视化、软件、方法、形式分析、数据整理。Teodora Ran?elovi?：撰写审阅与编辑、监督、方法。Ignacio Ochoa：撰写审阅与编辑、监督、资源、项目管理。

伦理声明

已获取所有参与者或其法定代表参与研究并发布论文的书面知情同意。参与者隐私权得到尊重。本研究包含器官或组织捐赠者。本研究包含人类生物材料，已获捐赠者、其近亲属或法定代表同意用于本研究及论文发布。本研究中使用的样本未源自执行死刑的个体。

生成式人工智能和人工智能辅助技术在论文准备过程中的声明

在准备本工作期间，作者使用了Anthropic（Claude Sonnet 4.6）和OpenAI（GPT-5.5 Instant）工具以改善论文结构和语言、进行部分文献搜索以及编写LaTeX数学推导。在审阅过程中，作者使用了Anthropic（Claude Opus 5）作为校对文本的替代工具。使用此工具/服务后，作者审阅并编辑了所需内容，并完全承担责任。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本研究中报告的工作。

致谢

作者感谢西班牙科学、创新与大学部（MICIU）、国家研究局（AEI）以及FSE+、欧盟通过GBM_IMMUNE项目（PID2021-126051OB-C41:/AEI/10.13039/501100011033/FEDER, UE）以及FPI资助（PRE2022-102428）提供的财政支持。Manuel Doblare感谢中国国家外国专家项目（资助号S20250250）的支持。此外，作者感谢Raquel B. Arroyo-Vázquez、Guillermo Mora-Ruiz、Marina Pérez-Aliacar、Teodora Ran?elovi?、Ignacio Ochoa、Manuel Doblare、José A. Sanz-Herrera和Jacobo Ayensa-Jiménez提供的财政支持，他们均来自组织微环境实验室，阿拉贡工程研究所，西班牙萨拉戈萨大学。