年龄对雌雄Wistar Han大鼠水回避应激诱导疼痛表型影响的初步研究

《Continence》：A pilot study on the impact of age on pain induced by Water Avoidance Stress in female and male Wistar Han rats

　　

：间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（Interstitial Cystitis/Bladder Pain Syndrome，IC/BPS）是一种持续或复发的慢性盆腔疼痛、压迫感或不适感，被认为与膀胱相关，并伴有至少一种泌尿系统症状，如尿急或尿频。IC/BPS的症状表现随年龄而变化：年轻患者更常报告盆腔和生殖器疼痛、性交痛、尿频和尿急；而老年患者则更多表现为夜尿、尿失禁以及更高的Hunner病变发生率。尽管对IC/BPS机制的认识不断加深，但衰老对疼痛和膀胱活动的影响仍不清楚，这凸显了对纳入年龄因素的转化模型的需求。鉴于IC/BPS的多因素发病机制以及人体研究的固有局限性，动物模型对于解析疾病机制和评估治疗干预至关重要。水回避应激（Water Avoidance Stress，WAS）模型已成为研究IC/BPS的一种非膀胱中心范式，该模型可再现心理应激对膀胱感觉和功能活动的影响，并在年轻成年雌性大鼠中表现出一定的构念效度和表面效度。然而，现有WAS方案尚未系统性地纳入衰老变量，限制了其转化适用性。在本研究中，研究人员旨在探讨衰老是否调节WAS模型中的膀胱相关疼痛感知，并确定排尿斑点分析（Voiding Spot Assay，VSA）能否以衰老为范式检测疼痛相关的膀胱活动变化。研究使用雌性和雄性Wistar Han大鼠，按年龄分为成年（6-7月龄）、中年（15-18月龄，雌性去卵巢）和老年（23-25月龄）组。研究评估了自发疼痛行为（大鼠面部痛苦量表，Rat Grimace Scale，RGS）、热刺激阈值（Hargreaves试验）和机械刺激阈值（von Frey试验），并采用VSA评估自发性膀胱活动。结果显示，WAS诱导的疼痛表型随年龄增长而减弱；面部痛苦量表可能需要针对盆腔疼痛评估进行适应调整；排尿斑点分析可能不适用于研究老年动物中WAS诱导的膀胱活动变化。

论文解读文章

一、研究背景与目的

间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（Interstitial Cystitis/Bladder Pain Syndrome，IC/BPS）是一种以持续或复发性慢性盆腔疼痛为特征的疾病，疼痛与膀胱相关，并伴有尿急或尿频等泌尿症状。IC/BPS的症状表达随年龄呈现显著差异：年轻患者更常报告盆腔和生殖器疼痛、性交痛、尿频和尿急，而老年患者则更多表现为夜尿、尿失禁及更高的Hunner病变发生率。然而，衰老对疼痛感知和膀胱活动的具体影响机制仍不明确，现有研究缺乏年龄包容性的转化模型。由于IC/BPS发病机制的多因素性以及人体研究的局限性，动物模型成为解析疾病机制和评估治疗干预的重要工具。水回避应激（Water Avoidance Stress，WAS）模型作为一种非膀胱中心的应激范式，已被用于研究心理应激对膀胱感觉和功能活动的影响，并在年轻成年雌性大鼠中表现出增强尿频和膀胱痛觉过敏的表型。但现有WAS方案尚未系统纳入衰老变量，其转化适用性受限。基于此，研究人员开展了本项初步研究，旨在探讨衰老是否调节WAS模型中的膀胱相关疼痛感知，并评估排尿斑点分析（Voiding Spot Assay，VSA）能否以衰老为范式检测疼痛相关的膀胱活动变化。

二、研究设计与方法

本研究采用前后对照设计，共使用30只Wistar Han大鼠，每组6只，按性别和年龄分为雌性成年组（F6M，6-7月龄）、雌性去卵巢中年组（F15M，15-18月龄，实验前1个月行双侧卵巢切除术以消除动情周期激素波动）、雌性老年组（F23M，23-25月龄）、雄性成年组（M6M，6-7月龄）和雄性老年组（M23M，23-25月龄）。大鼠年龄对应人类成年、中年和老年阶段。WAS诱导方案为将动物置于装满37°C水的笼子中央平台上，每天1小时，连续10天。行为测试和膀胱活动评估在WAS诱导前（基线）及诱导结束后第1天（D11）和第2天（D12）进行。研究采用的主要关键技术方法包括：大鼠面部痛苦量表（Rat Grimace Scale，RGS）评估自发疼痛行为，对眶周收紧、鼻/颊扁平化、耳部变化和胡须变化四个面部动作单元进行0-2分评分；Hargreaves试验评估热刺激阈值，在L6-S1皮节（生殖器/大腿）和L3-L5皮节（后爪）施加辐射热刺激，记录缩爪潜伏期；von Frey Up-and-Down法评估机械刺激阈值，使用9根不同力度的纤维丝（1.4-60g）测定50%反应概率对应的机械退缩阈值（LD₅₀）；排尿斑点分析（VSA）评估自发排尿活动，将动物置于无垫料但有滤纸覆盖的笼中20分钟，在紫外光下标记尿斑，通过ImageJ软件量化面积并依据校准曲线换算尿量。统计分析采用Hedges' g_z效应量和配对比较，在RStudio中完成。

三、研究结果

3.1 疼痛相关行为

3.1.1 面部痛苦量表分析

成年雌性（F6M）在WAS后平均面部痛苦评分从基线0.17±0.11升至0.38±0.06，效应量大（g_z=1.25，p=0.006）。去卵巢中年雌性（F15M）从0.15±0.07升至0.49±0.18，效应量大（g_z=1.57，p=0.059）。老年雌性（F23M）从0.20±0.14升至0.38±0.24，效应量大（g_z=0.94，p=0.059）。成年雄性（M6M）从0.21±0.19升至0.60±0.34，效应量中等（g_z=0.75，p=0.032）。老年雄性（M23M）基线为0.40±0.52，WAS后为0.41±0.42，效应量可忽略（g_z=0.01，p=0.98）。结果表明年轻成年动物表现出WAS诱导的自发疼痛，而老年雄性无明显反应。

3.1.2 Hargreaves试验——生殖器/大腿刺激

成年雌性（F6M）热刺激潜伏期从基线12.3±4.5秒降至WAS后5.1±1.6秒，效应量大（g_z=-1.09，p=0.002）。去卵巢中年雌性（F15M）从11.9±5.4秒变为11.8±4.8秒，效应量可忽略（g_z=0.003，p=1.00）。老年雌性（F23M）从9.1秒变为7.95秒，效应量可忽略（g_z=-0.15，p=0.63）。成年雄性（M6M）从9.5±6.0秒变为8.2±2.3秒，效应量可忽略（g_z=-0.12，p=0.77）。老年雄性（M23M）从14.4±2.4秒升至16.6±2.2秒，效应量小（g_z=0.41，p=0.231）。结果表明仅成年雌性在生殖器/大腿区域表现出WAS诱导的热痛觉过敏。

3.1.3 von Frey试验——生殖器/大腿刺激

成年雌性（F6M）机械阈值从基线8.2±10.0克降至WAS后1.3±0.1克，效应量中等（g_z=-0.58，p=0.0005）。去卵巢中年雌性（F15M）从10.1±4.1克降至6.9±5.4克，效应量小（g_z=-0.34，p=0.39）。老年雌性（F23M）从19.0±20.7克降至5.78±4.08克，效应量小（g_z=-0.46，p=0.26）。成年雄性（M6M）从12.1±10.1克降至3.3±3.4克，效应量大（g_z=-0.86，p=0.03）。老年雄性（M23M）从18.2±23.6克降至6.4±1.7克，效应量小（g_z=-0.38，p=0.33）。结果表明成年雌性和成年雄性在生殖器/大腿区域表现出WAS诱导的机械痛觉过敏。

3.1.4 Hargreaves试验——后爪刺激

成年雌性（F6M）潜伏期从15.1±3.0秒变为12.8±4.9秒，效应量小（g_z=-0.35，探索性p=0.42）。去卵巢中年雌性（F15M）从12.3±1.9秒变为11.1±3.4秒，效应量小（g_z=-0.29，p=0.46）。老年雌性（F23M）从9.2±2.4秒变为7.6±4.0秒，效应量小（g_z=-0.37，p=0.33）。成年雄性（M6M）从10.7±3.2秒变为12.7±4.6秒，效应量小（g_z=-0.47，探索性p=0.34）。老年雄性（M23M）基线3/5值已达18.1秒截断值，WAS后5/5值均为18.1秒，数据严重右删失，无法计算效应量。结果表明WAS未在后爪区域诱导明显的热痛觉过敏。

3.1.5 von Frey试验——后爪刺激

成年雌性（F6M）机械阈值从基线13.03±3.9克降至WAS后4.3±4.8克，效应量大（g_z=-1.17，p=0.004）。去卵巢中年雌性（F15M）从10.0±6.30克升至13.8±9.8克，效应量中等（g_z=0.60，探索性p=0.26）。老年雌性（F23M）从32.1±22.7克降至20.7±12.3克，效应量小（g_z=-0.30，p=0.37）。成年雄性（M6M）从38.9±23.5克降至27.0±18.9克，效应量小（g_z=-0.32，探索性p=0.22）。老年雄性（M23M）从50.5±14.6克降至20.3±12.5克，效应量大（g_z=-1.23，p=0.004）。结果表明成年雌性和老年雄性在后爪区域表现出WAS诱导的机械痛觉过敏。

3.2 自发性膀胱活动

排尿斑点分析结果显示各组动物排尿斑点数量总体偏低。F15M和F23M组斑点极少，无法进行任何分析。F6M组在WAS后低容量斑点总数增加30%，在40-60微升范围内尤为明显，高容量斑点总数减少7%。M6M组在WAS后低容量斑点总数增加125%，尤其在50-80微升范围，高容量斑点总数增加233%。M23M组在WAS后低容量斑点总数减少16%，高容量斑点总数增加45%。

四、讨论与结论

讨论部分指出，年龄塑造了WAS诱导的疼痛表型：年轻成年动物表现出自发性和诱发性疼痛体征，而老年动物反应异质性高或反应微弱。年轻组表现出更明显的模态依赖性盆腔皮节敏感性，而多数组未显示后爪敏化，提示WAS激活了与膀胱等盆腔器官相关的伤害性通路。关于面部痛苦量表，研究中所有雌性均未达到Oliver等人基于Sprague-Dawley大鼠手术疼痛确定的0.67镇痛干预阈值，提示该量表对盆腔疼痛的敏感性可能不足，且可能存在品系间面部表情强度差异，建议针对盆腔疼痛模型考虑在0-1和1-2之间增加中间评分值，并需为Wistar大鼠建立RGS疼痛阈值。关于诱发痛，效应量分析显示WAS后热和机械变化在生殖器/大腿区域比后爪更显著，且机械变化比热变化更突出，这与人类膀胱牵涉痛的特征一致，增加了WAS模型的表面效度和机制效度。F15M组的异质性反应可能与衰老过程本身相关，F23M组中仅在基线阈值不低的雌性中观察到RGS与反应阈值的关系，提示条件性疼痛调节机制参与其中。雄性中，仅年轻雄性表现自发痛，但年轻和老年雄性均表现机械痛觉过敏，提示应激诱导的伤害性纤维调节可能不足以在老年雄性中引发自发痛。老年大鼠的疼痛异质性可能反映患者群体的异质性，仅按实际年龄分组可能不足以研究年龄相关的盆腔疼痛结局。关于膀胱功能，WAS增加了F6M和M6M组低容量斑点数量，可能反映膀胱反射活动增强；但M6M组总体排尿活动增加及M23M组高容量斑点增加，结合机械敏化，提示WAS可能优先增强机械性膀胱传入纤维活动，导致膀胱过度活动，并通过交叉敏化机制促进机械超敏，而非纯粹的疼痛驱动过程。VSA用于老年雌性研究存在局限性，因其可能呈现正常活动、过度活动或低活动等不同基线表型，且啮齿动物分段排尿导致斑点数量变异。研究未纳入膀胱或中枢神经系统组织，无法确定行为变化是否伴随形态学或组织化学改变。结论认为，年龄塑造了WAS诱导的疼痛表型，盆腔皮节中模态特异性敏化的优势支持膀胱相关伤害性通路的参与，增强了模型的表面效度和机制效度。雄性中疼痛相关行为与排尿模式的明显分离提示WAS可能并非纯粹疼痛驱动的状态。老年动物中观察到的变异性凸显了实际年龄作为生理状态代理指标的局限性，与临床人群的异质性一致，支持未来研究需进行基线表型分型、分层设计，并改进针对盆腔疼痛的行为学指标。年龄和性别均是塑造WAS诱导表型的关键生物学变量，支持优化临床前模型以更好捕捉膀胱疼痛综合征的复杂性并提高转化相关性。