《Clinical Microbiology and Infection》：EUCAST disk diffusion: Can Mueller-Hinton agar with 5% sheep blood (MH-S) be an alternative medium for fastidious organisms?
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摘要目标EUCAST推荐使用添加脱纤维马血清和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD）的Mueller-Hinton（MH）琼脂（MH-F）对苛养微生物进行纸片扩散试验，但在某些地理区域MH-F难以获取。本研究旨在评估添加绵羊血（MH-S）的MH琼脂作为替代培养基的可行性。方法
摘要
目标
EUCAST推荐使用添加脱纤维马血清和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD）的Mueller-Hinton（MH）琼脂（MH-F）对苛养微生物进行纸片扩散试验，但在某些地理区域MH-F难以获取。本研究旨在评估添加绵羊血（MH-S）的MH琼脂作为替代培养基的可行性。
方法
按照EUCAST推荐方案，在MH-F和MH-S上并行进行纸片扩散（DD）试验。除因在MH-S上生长不佳而排除的流感嗜血杆菌外，所有在MH-F琼脂上有折点的菌种均进行了检测。比较了在MH-F和MH-S上并行试验的生长情况和抑菌环直径，并按照EUCAST推荐方案计算了分类一致性。参照ISO 20776-2中最低抑菌浓度（MIC）评价的推荐方案，计算了基本一致性和偏差。此外，还比较了由三家制造商的MH琼脂制备的MH-S上抑菌环直径的分布情况。
结果
所有受检菌种在MH-S上的生长与MH-F上同等良好。MH-S与MH-F上纸片扩散结果的相关性良好，对于每种菌种/微生物组别，分别有61-85%、89-100%和95-100%的抑菌环直径差异在1毫米、2毫米和3毫米以内。按菌种分析时，MH-S的系统性偏差（bias）低于±30%；按药物分析时，32种药物中的25种偏差低于±30%。在MH-S上检测甲氧苄啶-磺胺甲恶唑对A、B、C和G组链球菌时，需要特定的判读说明。三种品牌MH琼脂对MH-S上的抑菌环直径无显著影响。
结论
MH-S可用于所有在MH-F上有EUCAST抑菌环直径折点的菌种的纸片扩散试验（流感嗜血杆菌除外，因其不能在MH-S上生长）。由于MH-F支持的菌种种类多于MH-S，除非另有说明，EUCAST将继续推荐使用MH-F作为苛养微生物纸片扩散试验的标准EUCAST培养基。最新信息可在EUCAST网站上查阅。
引言
EUCAST纸片扩散法根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）统一的最低抑菌浓度折点进行了校准，于2009年12月发表[1]。Mueller-Hinton（MH）琼脂被选为标准药敏试验培养基。通过在MH琼脂中添加5%机械脱纤维马血清和20 mg/L β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD），开发出一种用于苛养细菌纸片扩散试验的培养基（Mueller-Hinton苛养培养基，MH-F），以支持流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、A、B、C和G组链球菌、草绿色链球菌群、螺杆菌属、多杀巴氏杆菌、单核细胞增生李斯特菌、白假单胞菌属[2]的生长，后来又增加了几种苛养菌种1, 3。尽管MH-F通用性广且适用于多种苛养微生物，但已被证明不适用于厌氧菌和淋病奈瑟菌的纸片扩散试验。对于厌氧菌，目前推荐使用添加5%脱纤维马血清的苛养厌氧菌琼脂4, 5。在开发MH-F培养基期间，曾与一种使用绵羊血代替马血清的类似培养基进行比较。然而，使用绵羊血时流感嗜血杆菌的生长不佳，除非将β-NAD浓度至少提高五倍，这将显著增加培养基的成本[2]。
在某些地理区域，MH-F难以获取，原因可能是当地难以获得马血清、缺乏使用马血清的传统，或者预制平板的制造商在当地不供应该产品。EUCAST受到鼓励去研究苛养微生物纸片扩散试验的替代培养基，而无需重新校准整个EUCAST系统。在测试了多种替代培养基后，我们决定研究添加5%脱纤维绵羊血的Mueller-Hinton琼脂（MH-S），不添加β-NAD，因为已经明确该培养基在任何合理浓度下都无法支持流感嗜血杆菌的生长。MH-S被CLSI推荐用于部分但不全是苛养微生物的检测，因此该培养基在全球范围内均可获得[6]。
部分摘要
方法
按照EUCAST标准方法[1]进行纸片扩散试验，菌液浓度为0.5麦氏浊度，在5% CO2、35°C条件下孵育16-20小时，适用于所有推荐在MH-F上进行纸片扩散试验的菌种（除外白喉棒状杆菌和溃疡棒状杆菌，因安全法规排除在外）。EUCAST折点表v.16.0中所有具有抑菌环直径折点的抗菌药物均被纳入[3]。如前所述，流感嗜血杆菌未能在MH-S上生长
结果
MH-S和MH-F对所有纳入菌种均支持同等良好的生长（每菌种n=10-20，见表1），即生长均匀融合且外观上未观察到差异。此外，MH-S平板的制备所用MH琼脂制造商的选择不会影响生长特性。我们未观察到在两种培养基上判读的难易程度存在任何系统性差异，即抑菌环直径在两种培养基上判读的难易程度相同。
在初步试验中对10株肺炎链球菌的检测显示了良好的
讨论
本研究旨在调查添加5%脱纤维绵羊血的Mueller-Hinton琼脂（MH-S）是否可以替代EUCAST MH-F培养基，用于在难以或无法获取马血清或商业MH-F琼脂平板的地区的苛养微生物纸片扩散试验。在这些地区，绵羊血通常易于获得，且所有培养基制造商均提供商业琼脂平板。
MH-S对所有受检菌种均支持与MH-F同等良好的生长，包括
透明度声明
作者声明不存在利益冲突。在稿件撰写过程中未使用人工智能工具。
作者贡献
EM、GK、AP和ARL规划了本研究。SH和LR进行了实验室工作。SH、LR和EM进行了数据分析。EM和GK负责结果的解释和向EUCAST的汇报。所有作者均参与了论文的撰写。
资助
未获得外部资助。欧洲临床微生物和传染病学会（ESCMID）支持EUCAST发展实验室开展的开发工作。
致谢
感谢丹麦国家血清研究所的Lone Ryste Hansen Kildevang和Ditte Marie Brix，以及EUCAST发展实验室的Lucia Ortega Roco和Amra Basic进行纸片扩散试验。感谢瑞典卡尔克勒纳布莱金厄和克鲁努贝里临床微生物实验室的Anna-Karin Wallgren制作MH-F和MH-S平板。
Erika Matuschek|Simon Hintze|Lized Rodriguez|Andreas Petersen|Anders Rhod Larsen|Gunnar Kahlmeter
