《Clinical Traditional Medicine and Pharmacology》：Peiyuan xuanhua jiedu decoction potentiates SARS-CoV-2 vaccine-induced immunity via STAT3-dependent Tfh cell differentiation
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背景：呼吸道传染病具有高度传染性和流行性，对全球公共卫生构成严重威胁。疫苗接种是针对危及生命的呼吸道病毒感染的主要有效干预措施。然而，当前疫苗提供的免疫保护有限且持续时间短，损害了其临床效用。因此，安全且强效的新型免疫佐剂对于增强和维持疫苗触发的免疫应答至关重
背景：呼吸道传染病具有高度传染性和流行性，对全球公共卫生构成严重威胁。疫苗接种是针对危及生命的呼吸道病毒感染的主要有效干预措施。然而，当前疫苗提供的免疫保护有限且持续时间短，损害了其临床效用。因此，安全且强效的新型免疫佐剂对于增强和维持疫苗触发的免疫应答至关重要。培元宣化解毒方（PY）已在临床上被证实可缓解新型冠状病毒肺炎（COVID-19）症状，其活性与免疫增强、抗炎、抗氧化和免疫调节作用相关。
目的：本研究旨在表征PY方在严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）疫苗接种中的免疫佐剂活性，并阐明其潜在的细胞和分子机制。
方法：研究人员建立了一个SARS-CoV-2疫苗接种小鼠模型，以评估PY方的体内佐剂功效。通过抗体滴度评估疫苗诱导的体液免疫应答。采用流式细胞术分析关键的免疫细胞亚群，包括B细胞、浆细胞、滤泡辅助性T细胞（Tfh）、生发中心B细胞（GCB）和记忆T细胞。整合网络药理学和转录组学分析，以确定核心调控信号通路。
结果：与仅接种疫苗组相比，PY方在早期和晚期时间点均显著增加了受体结合域（RBD）结合免疫球蛋白G（IgG）抗体滴度。在免疫应答高峰的第28天，PY组的几何平均滴度（GMT）达到1:6,400，是仅接种疫苗组（GMT: 1:2,000; P < 0.01）的3.2倍。在第120天，PY组的GMT维持在1:3,200，而仅接种疫苗组降至接近基线水平（GMT: 1:400; P < 0.001），表明抗体持久性延长。在第120天的中和抗体方面，在1:80稀释度（平均值：9.6% 对比 28.6%）和1:320稀释度（23.3% 对比 45.1%）下，PY组表现出比仅接种疫苗组更低的水疱性口炎病毒（VSV）-SARS-CoV-2感染率，lg(pVNT50)值分别为~2.0 对比 ~1.7，表明其中和能力增强。PY方还诱导了辅助性T细胞1型/2型（Th1/Th2）相关细胞因子的短暂升高，驱动早期免疫激活。从机制上讲，PY方上调了B细胞共刺激分子分化簇40（CD40）和分化簇80（CD80），促进了浆细胞和Tfh细胞的生成而不影响GCB细胞的形成，并增强了T细胞活化和记忆T细胞发育。进一步的实验验证了PY方通过激活白细胞介素-6（IL-6）-信号转导及转录激活因子3（STAT3）信号通路促进Tfh细胞分化。值得注意的是，本研究的结果扩展了当前的理解，证明了一种多草药中药复方能够通过STAT3依赖的Tfh分化来维持疫苗诱导的体液免疫，这与以往主要关注短期抗体应答的中药佐剂研究形成对比。
结论：口服PY方通过调节B细胞和T细胞的分化及功能成熟，增强并稳定了疫苗诱导的免疫应答。IL-6-STAT3依赖性地促进Tfh细胞分化是其发挥免疫佐剂效应的核心机制。
论文解读：培元宣化解毒方作为SARS-CoV-2疫苗免疫佐剂的机制研究
1. 研究背景与科学问题
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行对全球公共卫生构成了巨大威胁。尽管各类COVID-19疫苗，如信使核糖核酸（mRNA）疫苗、腺病毒载体疫苗、灭活病毒疫苗和重组蛋白疫苗，已被证实是预防重症COVID-19最有效的策略之一，但仍面临严峻挑战。首先，多数疫苗的保护效力在约6个月后显著下降，需要加强免疫才能维持长期保护。其次，突破性感染和再次感染在已接种人群中频发。特别是灭活疫苗，虽然安全性高、适用人群广，但其免疫原性相对较弱。因此，迫切需要寻找安全、经济、可及的免疫增强策略，以提高SARS-CoV-2疫苗诱导免疫应答的强度和持久性。
传统中药（TCM）以其免疫调节作用闻名，且具有悠久的口服安全历史。基于全国COVID-19诊疗方案和省级医学专家的验证，由浙江中医药大学温成平教授经验方形成的培元宣化解毒方（PY），由苦杏仁、金银花、虎杖等11味中药组成，核心治则为健脾益肺、宣肺化湿解毒。临床研究已证实其能缓解COVID-19患者症状、延缓疾病进展并提高临床治愈率。鉴于其组成药材具有免疫调节、抗炎和抗氧化特性，研究人员假设PY方可能增强灭活SARS-CoV-2疫苗诱导的免疫应答。本研究旨在系统阐明PY方的免疫佐剂活性及其潜在的细胞和分子机制。
2. 主要技术方法
研究人员采用了多种关键技术：建立了雌性BALB/c小鼠SARS-CoV-2疫苗接种模型进行体内药效评价；利用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清RBD特异性IgG抗体滴度；使用基于水疱性口炎病毒（VSV）的SARS-CoV-2刺突假病毒进行中和试验；运用流式细胞术分析脾脏和骨髓中多种免疫细胞亚群，包括B细胞、浆细胞（PLS）、滤泡辅助性T细胞（Tfh）、生发中心B细胞（GCB）和记忆T细胞；通过超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）和高性能液相色谱（HPLC）进行化学成份鉴定与质量控制；整合网络药理学分析和Tfh细胞转录组测序（RNA-seq）预测核心调控靶点与通路；并通过体外Tfh分化实验、双荧光素酶报告基因实验、蛋白质印迹法（Western blot）和分子对接等技术进行机制验证。
3. 研究结果
3.1 PY方给药增加SARS-CoV-2疫苗免疫小鼠的RBD结合抗体滴度，延长抗体持久性，并显示出增强的中和能力趋势
与仅接种疫苗组相比，PY组小鼠在初次免疫后第13天、第28天和第120天的血清RBD特异性IgG抗体滴度均显著更高。在第28天免疫应答高峰期，PY组的几何平均滴度（GMT）达1:6,400，是仅接种疫苗组（GMT: 1:2,000）的3.2倍。在第120天，仅接种疫苗组的抗体滴度降至接近空白对照组水平，而PY组仍维持在高水平（GMT: 1:3,200）。在第120天的假病毒中和试验中，在1:80和1:320血清稀释度下，PY组血清的VSV-SARS-CoV-2感染率均低于仅接种疫苗组，lg(pVNT50)值也更高，表明PY处理增强了血清的中和能力。
3.2 PY方处理诱导SARS-CoV-2疫苗免疫小鼠相关细胞因子的短期升高
在第28天，PY组血清中白细胞介素-10（IL-10）、IL-5、IL-6、IL-1β和趋化因子配体1（CXCL1）水平高于空白组，而肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平低于仅接种疫苗组。在第120天，PY组干扰素-γ（IFN-γ）、IL-2和IL-5水平高于空白组，且IL-5水平也高于仅接种疫苗组。这表明PY方处理诱导了Th1和Th2相关细胞因子的短暂升高，从而促进体液和细胞免疫应答。
3.3 PY方处理促进浆细胞和滤泡辅助性T细胞的生成
在第120天，PY组小鼠脾脏中浆细胞（PLS）和滤泡辅助性T细胞（Tfh）的频率显著高于空白组，但生发中心B细胞（GCB）无显著差异。此外，PY组脾脏中分化簇40阳性（CD40+）和分化簇80阳性（CD80+）B细胞的比例以及B细胞上CD40和CD80的表达水平均显著升高。这些结果表明PY方通过上调B细胞共刺激分子，促进Tfh细胞分化和浆细胞生成，从而增强抗体应答。
3.4 PY方处理促进T细胞活化并增强T细胞的免疫记忆
在第120天，PY组小鼠脾脏中分化簇69阳性（CD69+）分化簇4阳性（CD4+）T细胞频率高于空白组，分化簇25阳性（CD25+）分化簇8阳性（CD8+）T细胞水平高于空白组和仅接种疫苗组。在体外抗原再刺激实验中，PY组脾细胞中活化的CD8+ T细胞（CD69+CD137+CD8+）比例显著高于仅接种疫苗组。这说明PY方促进了T细胞活化，并特别增强了CD8+记忆T细胞的应答。
3.5 PY方的化学成分鉴定
通过UHPLC-MS/MS分析，从PY方中鉴定或初步表征了132种化学成分，包括黄酮类、苷类、萜类、酚酸类等。HPLC定量分析显示，苦杏仁苷、虎杖苷和绿原酸是其主要生物活性成分，浓度分别为97.22 μg/mL、129.29 μg/mL和156.49 μg/mL。
3.6 网络药理学分析确定了PY抗SARS-CoV-2的候选靶点和过程
网络药理学分析发现，PY方的179个潜在靶点与1493个COVID-19相关靶点有64个重叠。蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析将STAT3确定为枢纽靶点。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析表明治疗靶点主要涉及脂质与动脉粥样硬化、病毒感染（包括COVID-19）以及T细胞分化（包括T细胞受体信号通路）。基因本体论（GO）分析显示分子功能主要集中在细胞因子活性、受体结合和DNA结合转录因子结合。
3.7 转录组数据揭示了PY增强SARS-CoV-2疫苗免疫应答的潜在靶点和过程
对分选的Tfh细胞进行mRNA测序，在仅接种疫苗组和PY组之间鉴定出617个差异表达基因（DEGs）。GO富集分析显示这些基因主要参与抗病毒防御反应、T细胞活化调控、T细胞分化、B细胞活化、白细胞介素-6产生等过程。热图显示，与Tfh细胞分化密切相关的IL-6ST和STAT3基因在PY处理后表达升高。
3.8 PY方处理通过激活STAT3促进Tfh细胞分化
体外Tfh分化实验显示，PY处理显著增加了Tfh细胞比例，而STAT3抑制剂Stattic则显著降低该比例。双荧光素酶报告基因实验表明，PY处理的血清能以剂量依赖方式增加STAT3转录因子活性。蛋白质印迹结果进一步证实，PY方处理显著上调了免疫小鼠脾淋巴细胞中STAT3的磷酸化水平。这些结果共同证明了PY方通过激活IL-6-STAT3信号通路促进Tfh细胞分化。
3.9 STAT3与PY方化学成分的结合相互作用
分子对接分析显示，PY方中的代表性活性成分，如虎杖苷、绿原酸、甘草香豆素、苍术内酯I、苦杏仁苷和党参炔苷，与人源（6NUQ）和小鼠源（6QHD）的STAT3蛋白均表现出强烈的结合亲和力（结合自由能低于-5 kcal/mol），主要通过氢键和疏水相互作用。
4. 总结与讨论
本研究首次系统证明，口服PY方能显著增强并延长灭活SARS-CoV-2疫苗在小鼠模型中诱导的体液和细胞免疫应答。其主要创新点和意义在于：第一，首次报道了一个经临床验证用于治疗COVID-19的多草药复方能够作为疫苗免疫增强剂；第二，通过长达120天的纵向观察，揭示了PY方不仅能提升抗体峰值，更能维持抗体的长期持久性，这在既往中药佐剂研究中未见报道；第三，整合网络药理学、转录组学和多层次功能验证，阐明了PY方通过激活IL-6-STAT3信号通路、促进Tfh细胞分化这一核心机制。研究结论明确指出：口服PY方通过调节B细胞和T细胞的分化及功能成熟，增强并稳定了疫苗诱导的免疫应答，其核心机制是IL-6-STAT3依赖性地促进Tfh细胞分化。该研究为开发安全、有效的中药来源疫苗佐剂提供了坚实的理论和实验基础，尤其对于解决灭活疫苗免疫原性较弱的临床瓶颈具有重要意义。
