分子量明确的β-环糊精聚合物（pCDs）通过多结合模式高效负载利奈唑胺（LZD）：实验与分子模拟研究

《Carbohydrate Polymers》：Cyclodextrin polymers efficiently incorporate linezolid through multiple binding modes: insights from experiments and molecular simulations

　　

环氧氯丙烷（ECH）交联的β-环糊精聚合物（pCDs）是可增溶难溶性分子并具有内在生物活性的多功能药物载体。然而，传统合成pCDs的宽分散性和不明确结构阻碍了分子水平的结构-性质关联。研究人员报道了具有明确分子量和低分散度的pCDs的合成，并对其组成、尺寸和超分子组织进行了全面表征。所有pCD组分均使利奈唑胺（LZD）的增溶程度显著高于天然βCD，且稳定常数与分子量无关。核磁共振（NMR）波谱揭示了LZD在βCD空腔内的倾斜芳香插入几何构型，并识别出聚合物特有的腔间微区中的额外药物相互作用。首次构建的pCD原子模型用于分子对接和微秒级分子动力学（MD）模拟。LZD优先与腔间区域结合，而非发生自发空腔包合，其结合主要受动力学和位阻限制而非几何不相容性。这些发现表明pCDs通过多种互补模式结合药物，并证明以实验为依据的原子模拟是合理设计碳水化合物基药物递送平台的有力框架。

研究背景与问题：环糊精（CDs）是现代药物递送的核心工具，尤其用于难溶性或难以制剂化的药物。环氧氯丙烷（ECH）交联的β-环糊精聚合物（βCD polymers，pCDs）是最早报道的聚合CD平台之一，兼具βCD主客体性质与可容纳多种治疗分子的三维聚合物网络。然而，水溶性pCD的合成天然产生异质产物，摩尔质量分布宽且呈双峰，跨越10⁴至10⁶ Da，妨碍实验表征和稳健结构-性质关系的建立。pCDs除作为增溶辅料外，约47 kDa的pCDs显示内在抗结核活性；乙硫异烟胺及其增效剂可在pCDs中共载，并在结核动物模型中显著降低肺部细菌载量；药物结合被认为涉及βCD空腔和交联产生的微区，但其结构基础仍不清楚。利奈唑胺（LZD）用于肺炎、皮肤感染和耐多药结核，临床用途受水溶性差和剂量依赖性毒性限制；LZD与βCD及衍生物的包合物已有报道，但与交联βCD聚合物的相互作用尚未探索。研究人员据此提出假设：ECH交联βCD聚合物对LZD的络合独立于分子量，并由经典βCD空腔包合和聚合物特有的腔间结合微区共同决定，这些微区对相对天然βCD的增溶增强有显著贡献。该论文发表在《Carbohydrate Polymers》。研究意义在于建立pCD多模式药物结合的分子框架，并展示基于实验的原子模拟可用于碳水化合物基药物递送平台的理性设计。

关键技术方法：研究人员在强碱条件下以ECH交联βCD合成pCD，并经透析分为低、中、高分子量组分LpCD、MpCD、HpCD；采用定量¹H NMR、SEC-MALS-DRI-IV、DLS、TEM和Ostwald黏度计表征组成、分子量、尺寸、形貌和溶液流变；采用相溶解度法、HPLC、透析平衡及¹H/¹⁹F/二维NMR研究LZD结合与解离；基于实验数据用HTPolyNet构建LpCD原子模型，结合AutoDock Vina分子对接、GROMACS分子动力学（MD）和US/WHAM计算结合自由能。未涉及临床样本队列。

研究结果：3.1 Polymer synthesis and characterization：通过碱催化ECH交联βCD并透析分级，得到LpCD、MpCD、HpCD；NMR显示各组分βCD含量约80 wt%且无分子量依赖的组成差异；SEC-MALS-DRI-IV测得M_w分别约47.1、97.2、230 kDa，分散度1.6–2.1；DLS、TEM显示球形形貌且尺寸与溶液测量一致；本征黏度低且弱依赖M_w，表明紧凑、密集分支、近硬球结构。由此建立组成相同而M_w、流体力学尺寸和流变系统变化的平台。

3.2 Phase solubility and dissociation behavior of LZD from pCD：相溶解度图为线性A_L型；pCDs溶解性高于250 mg/mL，βCD当量约200 mg/mL，而天然βCD约18 mg/mL；LZD固有溶解度3.0±0.2 mg/mL；150 mg/mL LpCD使LZD达26.1±0.2 mg/mL，高于既往ECH交联βCD聚合物报道；天然βCD的K_app为1302±467 M^?1，pCD组分为194–219 M^?1，斜率无显著差异，说明增溶效率不随M_w显著改变；作者强调pCD的K_app为整合可及空腔和其他相互作用的表观宏观参数。透析中LZD·LpCD平衡时外室浓度仅为内室约5%，由平衡估计的K_app为332±138 M^?1，与相溶解度一致。LpCD因等效增溶、主要产率和内在抗菌活性被选后续研究。

3.3 NMR studies of LZD·pCD complexes：在LZD饱和条件下，βCD内腔质子H-3和H-5最大上移0.17–0.27 ppm，外表面H-2和H-4基本不变，客体质子呈屏蔽与去屏蔽并存，支持部分包合；LpCD中同样见H-3/H-5上移而H-2/H-4不变，但质子9在βCD中上移、在LpCD中可重复下移，提示部分LZD位于羟基丰富腔间微区；滴定实验中H-5逐步上移而H-2/H-4不变，¹⁹F NMR见系统性上移，二维¹H/¹⁹F HOESY、ROESY和DOSY证实接触与共扩散；NMR估计K_app为395 M^?1，与HPLC结果一致。结论为LZD以倾斜芳香插入方式结合，LpCD中经典包合与次级相互作用共存，形成动态异质结合模式。

3.4 Simulations：3.4.1 Native βCD reference and binding free energy：对接最低能姿态显示芳香环经secondary rim插入，morpholine朝向该缘、氟原子靠近边缘、acetamide朝primary rim；MD中保持稳定，平均COM距离3.27 ?、角度约20°；US/WHAM得标准结合自由能?18.7±2.5 kJ/mol，数值接近相溶解度估计的?17.7 kJ/mol，但作者指出二者框架不同，不应直接等同。3.4.2 Atomistic model of LpCD：基于NMR和SEC数据用HTPolyNet构建含33个βCD和125个连接子的LpCD模型，M_w 47,814 g/mol、密度1347 kg/m³，呈紧凑球状；HYDROPRO计算D_h 5.34 nm，与SEC/DLS一致；R_g 1.81 nm，ρ=R_g/R_h=0.678低于硬球理论值0.778，提示核密球状结构；密度图显示网络异质、内部水耗竭、局部水化腔间区和富水外围。3.4.3 Binding landscape of LZD within LpCD：盲对接最低能姿态BSA 2.73–3.58 nm²、COM距离19.39–25.39 ?，LZD偏好聚合物周边并聚为A、B、C三个腔间微区，局部对接每个口袋得到三种结合模式；1 μs MD中LZD始终保持结合但不形成33个βCD空腔的经典包合，COM均值22.77 ?，持续探索表面和瞬态腔间区域；约550 ns后BSA增加、LpCD的R_g下降，LZD内部RMSD稳定而结合RMSD继续演化，说明聚合物慢松弛和压缩重塑结合景观而非发生包合事件；LpCD中LZD氢键占据0.79 HB/frame，高于βCD的0.20，>60%发生在secondary rim，N2、O3和F参与最多；βCD的O2–O3分子内氢键带在LpCD中平均占据仅11%，空腔柔性增加；33个βCD空腔CV分布宽，22/33在MD后畸变增加，CV波动与RMSF、R_g方差和SASA方差强相关；PCA的PC1（36.8%）描述柔性梯度，PC2（16.9%）描述构象扩张和空腔可及性，合计53.7%。3.4.4 Assessing inclusion compatibility in LpCD：对33个βCD分别进行100 ns受限MD，将LZD初始置入空腔并施加弱位置约束，20/33（60.6%）保持稳定结合，表明畸变空腔仍结构兼容；因此无自发包合主要不是变形所致，而是交联网络施加的位阻和动力学限制，与实验中需数天达到平衡一致；作者指出不能排除更长时间尺度发生空腔包合，多种动态结合模式可共存。

讨论与结论：作者总结指出，pCD组分的K_app应视为整合可及空腔和其他LZD-聚合物相互作用的表观全局参数，而非单一1:1包合的微观热力学常数；LZD在pCD中可通过瞬态或稳定空腔包合以及腔间区域吸附等多种动态模式结合。讨论部分还指出，模拟使用通用GAFF力场而非碳水化合物专用模型，未来可采用更适配CD体系的力场并延长模拟时间以解析慢结合动力学。研究结论翻译如下：通过结合理化表征、NMR波谱和分子建模，本工作首次对分级ECH交联βCD聚合物及其与LZD的相互作用进行了系统结构-性质研究。研究人员分离出三种M_w不同但组成相似（约80 wt% βCD）且具有紧凑球状结构的聚合物组分，其LZD增溶能力显著高于天然βCD；由相溶解度分析、NMR波谱和透析平衡独立测定的表观稳定常数高度一致且不依赖M_w。NMR和分子模拟揭示，LZD结合不仅来自经典CD空腔包合，还来自交联聚合物网络形成的腔间微区内的相互作用；这些天然βCD中不存在的聚合物特有环境显著促进药物结合，并有助于解释pCD更优的增溶能力。本工作的主要成果之一是证明可在实验相关M_w下构建真实的CD聚合物原子模型，并用于研究分子水平的药物-聚合物相互作用；模拟显示LZD优先占据表面可及的腔间区域，而空腔包合受聚合物网络施加的动力学和位阻限制而非空腔不相容限制。总体而言，交联CD聚合物中的药物结合不仅由CD含量决定，还由网络三维组织决定，后者产生天然βCD中不存在的异质结合位点集合；本工作确立模拟为阐明复杂CD聚合物结构-性质关系的有力工具，并为合理设计下一代碳水化合物基药物递送系统提供了框架。