间歇性甲状旁腺激素缓解环磷酰胺损伤的拔牙窝愈合中血管生成-成骨耦联模式

《Biomedical Journal》：Intermittent Parathyroid Hormone Mitigates Cyclophosphamide-Impaired Angiogenic-Osteogenic Patterns during Socket Healing

　　

环磷酰胺（Cy）损害拔牙窝早期血管侵袭和骨形成；间歇性甲状旁腺激素（iPTH）可能通过血管效应部分改善骨形成；血管模式破坏可能在药物相关性颌骨坏死（MRONJ）相关应激下驱动成骨缺陷；凝集素注射联合组织透明技术可实现拔牙窝三维血管观察；部位特异性效应凸显了血管-骨微环境调控的重要性。

研究背景与科学问题

血管网络为组织提供氧气、营养和生长因子，并清除代谢废物，因此血管生成在组织发育、维持和再生中不可或缺。在骨再生过程中，血管内皮细胞同样发挥关键作用。目前已鉴定出三种骨内血管亚型——L型、H型和R型。其中，H型血管（CD31^hi/EMCN^hi）与成骨密切相关，其在老龄和骨质疏松小鼠及人类中数量显著减少；而R型血管（CD31^low/EMCN^hi）则与骨重塑相关，其减少被认为导致骨小梁体积下降。这些发现共同提示，血管生成障碍会损害骨再生和骨骼稳态。

药物相关性颌骨坏死（MRONJ）是与抗吸收药物（单用或联合免疫调节剂或抗血管生成药物）相关的严重并发症，其特征为拔牙后骨愈合受损和骨坏死。化疗药物如环磷酰胺（Cy）已被报道可加重人类MRONJ病变及MRONJ样动物模型。MRONJ的致病机制尚不完全清楚，而成骨细胞和血管内皮细胞功能障碍以及骨髓抑制被认为是可能的促成因素。尽管Cy单独使用并不构成MRONJ小鼠模型，但其免疫抑制和抗血管生成效应可能参与MRONJ发病的风险因素。

甲状旁腺激素（PTH），特别是间歇性给药（iPTH），已被众多研究证实可增强成骨和H型血管生成。虽然血管生成-成骨耦联及H型血管的时空组织特征已在长骨和颅骨中得到描述，但这些过程如何在血供丰富且具有独特口腔微环境的拔牙窝和颌骨中运作仍不完全清楚。本研究利用Cy和iPTH作为血管生成和成骨的相反调节因子，探究在Cy诱导的拔牙窝延迟愈合过程中，血管模式如何与骨再生协调。

研究概述与主要结论

研究人员通过体内小鼠拔牙模型结合体外细胞实验，系统评估了Cy和iPTH对拔牙窝愈合的影响。研究发现，Cy显著损害了拔牙窝早期的血管侵袭和骨形成，而iPTH能够部分改善Cy引起的骨密度（BMD）降低和某些血管形态指标，但未能完全恢复血管、成骨或破骨细胞相关结局。研究还首次采用凝集素注射联合组织透明技术实现了拔牙窝血管的三维可视化。这些发现强调了局部微环境在拔牙窝愈合中的重要性，并为理解MRONJ的早期血管功能障碍提供了新的视角。

关键技术方法

1. 1.
   动物模型：使用6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠，分为对照组（Ctrl）、环磷酰胺组（Cy）、环磷酰胺加间歇性甲状旁腺激素组（Cy+iPTH）和间歇性甲状旁腺激素组（iPTH）。Cy（150 mg/kg，腹腔注射）和iPTH（80 μg/kg，皮下注射）给药后进行拔牙，在第3天和第7天取材。
2. 2.
   显微计算机断层扫描（Micro-CT）：用于定量分析上颌拔牙窝内的骨体积（BV）、骨密度（BMD）和骨矿含量（BMC），以及股骨次级海绵骨的参数。
3. 3.
   组织学与免疫荧光染色：采用川本法切片进行苏木精-伊红（H&E）染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色以及针对Sp7/Osterix（Osx）、Endomucin（EMCN）和CD31的免疫荧光染色，以评估骨形成、破骨细胞活性及血管表型。
4. 4.
   组织透明与光片显微镜成像：通过CUBIC组织透明化处理和凝集素标记，结合光片荧光显微镜（Lightsheet 7）实现拔牙窝血管的三维可视化。
5. 5.
   体外细胞实验：使用人脐静脉内皮细胞系HUEhT-2和小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1，通过CCK-8实验、划痕愈合实验、管形成实验和RT-qPCR，评估4-氢过氧环磷酰胺（4-HC）和iPTH对细胞活力、迁移、血管生成和成骨分化的影响。

研究结果

3.1. iPTH部分改善Cy损害的拔牙窝愈合

通过Micro-CT和组织学分析，研究人员发现Cy降低了拔牙窝的钙化信号、BMD、BV/TV和BMC/TV。iPTH恢复了Cy处理后的BMD，但仅部分挽救了BV/TV和BMC/TV。H&E染色显示，Cy+iPTH组的编织骨面积数值高于Cy组，但未达到统计学显著性。TRAP染色表明，Cy在第3天和第7天均减少了TRAP阳性细胞数，而iPTH未能显著增加Cy处理小鼠的TRAP阳性细胞数。这些结果表明iPTH对Cy诱导的拔牙窝愈合损伤具有部分挽救效果，并强调了局部微环境的重要性。

3.2. 拔牙窝血管的定性光片可视化

通过光片成像，研究人员观察到血管从周围骨髓延伸至拔牙窝。第3天，伸入拔牙窝中央的血管主要为小直径且缺乏明显方向性模式；Cy标本显示中央拔牙窝区域血管信号稀少。到第7天，iPTH处理的样本中出现小直径血管。这些观察为后续二维免疫荧光结果提供了空间背景。

3.3. Cy和iPTH对CD31⁺EMCN⁺血管信号的影响

免疫荧光染色显示，第3天拔牙窝中的EMCN⁺血管样信号与周围骨髓相连，而CD31信号有限。定量分析表明，第3天Cy处理组几乎没有CD31⁺EMCN⁺血管。第7天，Cy显著降低了CD31⁺EMCN⁺面积/EMCN⁺面积分数和CD31⁺EMCN⁺面积/拔牙窝面积分数。虽然Cy+iPTH组的这两项指标数值均高于Cy组，但均未达到统计学显著性。这表明Cy诱导的CD31⁺EMCN⁺血管再生障碍未被iPTH显著恢复。

3.4. iPTH随时间推移改变血管生成反应的平衡，并部分对抗Cy诱导的血管-成骨分布紊乱

通过热图和核密度估计（KDE）曲线分析EMCN⁺血管和Osx⁺细胞的分布，研究人员发现Cy组第3天拔牙窝内侧血管较少，而Cy+iPTH组有部分改善。第7天，所有组均可见血管向拔牙窝中央长入，但Ctrl和iPTH组比Cy处理组显示出更多的小血管。KDE曲线显示，Cy组第7天出现明显的中央峰，提示血管模式延迟。血管形态定量分析表明，第3天Cy+iPTH组的EMCN⁺面积、血管长度和分支点数均显著高于Cy组；而第7天，Cy+iPTH组的分支点/EMCN⁺血管长度显著高于Cy组，但EMCN⁺面积和血管长度的差异不再显著。Osx⁺细胞的分布也显示，Cy处理后细胞向内迁移延迟，而iPTH有部分改善。这些发现表明iPTH治疗初期促进血管增殖，后期转向促进血管出芽，部分恢复了Cy导致的血管-成骨分布紊乱。

3.5. iPTH和Cy在内皮细胞和前成骨细胞样细胞中的差异性效应

体外实验显示，在HUEhT-2内皮细胞中，16 μM 4-HC降低细胞活力，iPTH在此浓度下显著提高活力；4-HC减少细胞迁移，而iPTH无论有无4-HC均增加迁移；iPTH总体上增加了管形成实验中的网格数。在MC3T3-E1前成骨细胞样细胞中，4-HC降低细胞活力，iPTH未能显著改善；在无4-HC时，iPTH减少细胞迁移；RT-qPCR结果显示，iPTH仅在16 μM 4-HC下增加Runx2表达，但未能恢复4-HC引起的Alpl降低。这些结果表明，iPTH最明显的改善作用体现在内皮细胞的活力和迁移上。

讨论与结论总结

本研究表明，血管生成支持骨发育和再生，Cy改变了拔牙窝早期愈合过程中的血管和成骨模式，并在体外损害了内皮细胞和前成骨细胞样细胞的功能。尽管iPTH改善了部分血管和矿化组织指标，但并未一致地恢复血管、成骨或破骨细胞相关结局。这是首次使用凝集素标记的组织透明技术三维可视化拔牙窝血管，为未来研究拔牙窝中血管生成-成骨耦联提供了有用的三维视角。

Micro-CT和组织学发现提示部分改善而非完全恢复。iPTH在Cy处理小鼠中主要改善了拔牙窝的BMD，而对股骨，iPTH仅改善了初级海绵骨参数而非次级海绵骨，这种部位特异性反应可能与H型血管的空间分布差异有关。H&E染色显示编织骨面积仅有数值增加，这可能与不同的组织定义、空间尺度以及较小的组织学样本量有关。Cy减少了TRAP阳性破骨细胞数量，而iPTH未显著增加，持续的破骨细胞抑制可能限制了重塑相关的耦联，从而导致了iPTH的部分效果。

免疫荧光和组织透明观察共同提示，Cy减少了早期血管向内侵袭、微血管分支形成和网络复杂性。iPTH表现出阶段依赖性的促血管生成作用，第3天促进血管面积、长度和分支，第7天则偏向于局部出芽。研究人员假设拔牙窝中新生成的血管来源于周围牙槽骨骨髓，且新生血管在第3天主要表现为EMCN⁺信号而CD31染色有限，这一表型更接近长骨中的R型血管。Cy抑制了血管增殖和向H型样表型的转变，而iPTH仅促进了血管增殖但未增加向H型样表型转变的比例。

分子机制方面，Cy已知抑制肿瘤血管中的VEGF/VEGFR2信号，而PTH增强VEGF表达，这种相反的调控可能部分解释了iPTH的早期恢复作用，但不完全的挽救和晚期对出芽的偏好提示存在其他机制。此外，Cy诱导的骨髓抑制破坏了内皮功能和造血微环境。

体外实验中，iPTH对HUEhT-2内皮细胞的改善作用最为明显，支持了内皮细胞可能参与体内部分挽救效果的贡献。但在MC3T3-E1细胞中，iPTH未能显著改善活力和迁移。

研究局限性包括：仅包含第3天和第7天两个时间点，无法评估后期骨成熟和重塑；仅使用6-8周龄雌性小鼠，限制了性别、年龄和合并症的评估；光片成像数据集较小且不平衡，仅用作定性空间背景；图像评估未设盲且部分量化涉及半手动步骤，可能存在观察者偏倚；分子机制未深入研究；Cy诱导的骨愈合缺陷不能直接等同于MRONJ样病变和人类MRONJ发病机制。尽管如此，本研究为Cy和iPTH作为成骨和血管生成调节剂下的血管生成-成骨耦联动态发展提供了重要信息。