《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Hepatocellular carcinoma (HCC) spheroid model exhibits a characteristic extracellular matrix-rich fibrous capsule hindering drug penetration
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肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，占所有肝癌病例的80%-90%。尽管诊断工具和新治疗策略取得了进展，但对治疗反应不佳仍是肝癌的重大挑战。本研究利用微孔阵列平台生物工程化制备了具有可控肝星状细胞与肝细胞比例的肝脏球体。含有LX-2细胞的球体在其外
肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，占所有肝癌病例的80%-90%。尽管诊断工具和新治疗策略取得了进展，但对治疗反应不佳仍是肝癌的重大挑战。本研究利用微孔阵列平台生物工程化制备了具有可控肝星状细胞与肝细胞比例的肝脏球体。含有LX-2细胞的球体在其外周形成了细胞外基质（ECM）包膜，类似于肝细胞癌组织。通过完整透明化球体的I型胶原蛋白免疫染色可视化了这种纤维样包膜。对该ECM包膜的酶促降解导致化疗药物阿霉素的治疗效果增强。总之，研究人员开发了一种可扩展且可控的HCC球体平台，该平台能够重现纤维化相关的ECM组织结构，并实现对ECM介导的药物渗透限制的系统性研究，同时展示了ECM重塑在改善药物递送方面的潜力，突显了该模型在评估针对纤维化肿瘤微环境的治疗策略中的应用价值。
一、研究背景与科学问题
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，约占所有肝癌病例的80%-90%。尽管诊疗技术不断进步，HCC对治疗的耐药性仍然是临床面临的重大挑战。肿瘤微环境（Tumor microenvironment, TME）在癌症进展、转移和免疫逃逸中发挥关键作用，其中细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）不仅作为物理支撑结构，还构成一道物理屏障，限制药物向肿瘤组织的渗透。在HCC中，由活化的肝星状细胞（Hepatic stellate cells, HSC）分泌的ECM在肿瘤周围形成特征性的纤维性包膜，这一结构在约40%-60%的HCC患者中被观察到，被认为与药物抵抗和不良预后密切相关。然而，传统的体外二维细胞培养模型无法有效模拟这一ECM包膜的结构与功能，而体内动物模型又存在种属差异和复杂性高等局限。因此，亟需建立能够重现HCC中ECM包膜特征的体外三维模型，以深入研究ECM介导的药物渗透障碍机制，并为开发联合ECM降解的新型治疗策略提供可靠的筛选平台。
二、研究内容与主要结论
研究人员利用软压印技术在培养皿中制作了含49个圆底微孔的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微孔阵列，通过离心法将不同比例的人肝细胞癌细胞系HepG2与人永生化肝星状细胞系LX-2共培养，制备了四种类型的球体模型：HepG2单培养球体、LX-2单培养球体、低ECM含量（LX-2:HepG2=1:4）共培养球体和高ECM含量（LX-2:HepG2=4:1）共培养球体。主要技术方法包括：采用CellTracker荧光探针标记细胞以观察空间分布；使用组织透明化结合免疫荧光染色对完整球体进行I型胶原蛋白（Collagen I）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）成像；扫描电子显微镜（SEM）观察球体表面超微结构；PrestoBlue代谢活性实验评估球体对小分子探针的渗透性；共聚焦显微镜结合自定义MATLAB脚本定量分析阿霉素（Doxorubicin, DOX）的渗透深度；以及通过胶原酶处理研究ECM降解对药物渗透和治疗效果的影响。
三、研究结果
3.1 HCC球体的形成与生长
通过微孔阵列平台成功制备了均一的球体。含有LX-2细胞的球体表现出更致密的结构，直径显著小于HepG2单培养球体。在10天培养周期内，含HepG2的球体直径呈增大趋势，而LX-2单培养球体尺寸保持稳定。批次间变异系数（CV）为0.74%-3.19%，表明该方法具有良好的可重复性。
3.2 HCC球体中的细胞组织分布
CellTracker标记显示，在共培养球体中，LX-2细胞优先分布于球体外周形成“壳层”，而HepG2细胞主要聚集在核心区域，呈现部分去混合现象。α-SMA免疫染色证实，共培养球体外周存在强烈的α-SMA阳性信号，且随时间推移表达增强，表明LX-2细胞被激活并向肌成纤维细胞表型转化。值得注意的是，HepG2单培养球体中也检测到α-SMA表达，提示这些细胞可能发生了上皮-间充质转化（EMT）。
3.3 HCC球体模型中ECM包膜的结构与分子评估
I型胶原蛋白免疫染色显示，所有四种球体均为胶原蛋白阳性。含有LX-2的球体在外周呈现出明显的纤维状胶原结构，形成类似HCC组织中的纤维性包膜，且在高ECM（4:1）球体中更为显著。经胶原酶处理后，胶原纤维结构被破坏，转变为弥散的“斑块”状结构。
3.4 ECM包膜的超微结构与渗透性表征
SEM观察显示，共培养球体表面比单培养球体更加光滑，提示更紧密的细胞间连接。胶原酶处理后，所有球体表面均出现孔隙结构，这与胶原包膜的降解一致。PrestoBlue代谢实验表明，LX-2含量越高、培养时间越长，球体对试卤灵（resorufin）的渗透性越低。在第10天，胶原酶处理显著提高了高ECM（4:1）球体的渗透性，表明ECM包膜确实构成了物质运输的屏障。
3.5 抗癌药物阿霉素在HCC球体模型中的渗透与疗效
DOX渗透深度定量分析显示，HepG2单培养和低ECM（1:4）球体的渗透深度相当（约82-84 μm），而随着LX-2比例增加，渗透深度显著降低至高ECM（4:1）球体的约55 μm和LX-2单培养球体的约51 μm。虽然胶原酶处理未引起渗透深度的统计学显著变化，但在所有含LX-2的球体中，DOX联合胶原酶处理组的细胞死亡率显著高于单独DOX处理组，且增效程度与LX-2比例正相关：低ECM（1:4）球体细胞死亡率增加20.1%，高ECM（4:1）增加28.7%，LX-2单培养增加34.4%。相比之下，HepG2单培养球体未见显著增效。
四、讨论与结论
本研究表明，通过共培养肝星状细胞与肝癌细胞构建的三维球体模型能够成功重现HCC组织中ECM纤维性包膜的关键特征。该包膜由活化的LX-2细胞分泌的I型胶原蛋白组成，其密度和屏障功能与LX-2细胞的比例正相关。该ECM包膜显著限制了小分子药物DOX的渗透，而胶原酶介导的ECM降解虽未显著改变DOX的宏观渗透深度，却显著增强了其对含LX-2球体的杀伤效果，提示ECM降解可能通过改善药物在局部区域的积累或改变微环境特性（如降低组织硬度、减少基质介导的存活信号）来增敏化疗。这一发现强调了ECM在HCC化疗耐药中的物理屏障作用，并为开发联合ECM降解的靶向治疗策略提供了理论依据。
研究结论翻译：研究人员建立了能够产生自身ECM包膜的HCC球体模型，该模型成功整合了HCC中TME的关键要素，包括活化肝星状细胞围绕肿瘤核心以及富含I型胶原蛋白的ECM包膜形成。组织透明化后的共聚焦显微镜揭示了球体外周的胶原纤维结构，其在含LX-2的球体中可被胶原酶降解。对不同化合物在不同培养时间的渗透性测试显示，ECM包膜作为屏障导致渗透性随时间下降。对具有ECM包膜的HCC球体进行胶原酶处理与小型化疗药物的更好递送相关，这间接体现在阿霉素更高的疗效上。这些结果凸显了建立捕捉HCC中影响肿瘤进展和治疗反应的TME关键特征的三维仿生模型的重要性。
