核酶激活的工程化crRNA实现了对碱性磷酸酶和金黄色葡萄球菌的CRISPR-Cas12a生物传感

《Biosensors and Bioelectronics》：A DNAzyme-activated engineered crRNA enables CRISPR-Cas12a biosensing of ALP and S. aureus

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  DNA酶激活的工程化crRNA实现了Mn²⁺门控Cas12a激活。
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  双crRNA补偿了crRNA工程化导致的活性损失。
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  锁定的e-crRNA在DNA酶介导的解锁之前抑制了背景激活。
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  它实现了无核酸扩增检测碱性磷酸酶（LOD：0.008 UL^-1）和金黄色葡萄球菌（LOD：29.76 CFU mL^-1）。

引言

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）系统是细菌和古菌中的适应性免疫机制（Jinek等人，2012）。其中，Cas12a等II类变体表现出独特的反式切割活性，在被与CRISPR RNA（crRNA）互补的目标DNA序列激活后，非特异性地降解单链DNA（ssDNA）（Li等人，2018）。这一特性使CRISPR-Cas系统成为分子诊断的有力工具（Chen等人，2018；Lu等人，2022）。然而，由于Cas12a通过Watson-Crick碱基配对依赖于DNA链（Hu等人，2025a；Li等人，2021），CRISPR-Cas12a的用途主要局限于核酸目标检测。非核酸目标检测的关键挑战在于其依赖于将信号间接转导为CRISPR系统的DNA激活剂，采用如适配体结合或变构转录因子开关等策略（Liang等人，2019；Xiong等人，2020）。这种方法固有的局限性在于CRISPR对核酸的检测限为皮摩尔级（未使用预扩增时），极大地限制了其实用性（Nguyen等人，2020a）。因此，开发能够敏感地将非核酸识别转化为强输出信号的无核酸扩增方法，对于实现CRISPR-Cas生物传感器至关重要。

为解决这一挑战，crRNA工程化已成为一种关键方法。它旨在将crRNA从固定的向导转变为一个平台，以便针对特定诊断需求定制Cas12a功能（Hu等人，2025b；Li等人，2017；Wen等人，2025）。近期研究表明，通过化学修饰、长度调整和环化等一系列策略，其可行性已得到验证。这些策略能够精确调控Cas12a活性。例如，一项研究通过在crRNA发夹中插入光裂解基团来沉默Cas12a活性。光照去除该基团后恢复活性（Liu等人，2024）。Huang等人将crRNA的5'端扩展为G-四联体结构域。一种名为吡啶烷啉的分子可结合并稳定该结构，从而抑制Cas12a活性（Huang等人，2025）。另一种策略是使用环状crRNA。这些环状结构可掩蔽其线性对应物的功能，使其无法参与Cas效应物组装（Wu等人，2023）。所有这些策略都是通过先初始抑制Cas12a活性，再通过特定刺激（如光照射或酶切）恢复活性来实现的。这些研究验证了crRNA可以被调控。但对于实际用于检测非核酸目标，必须解决两个关键问题。首先，我们需要一种将非核酸目标的识别转化为触发信号的方法。该信号必须通过有别于核酸杂交的机制来激活工程化crRNA。其次，由于crRNA的结构和功能完整性是Cas12a活性的关键决定因素，任何破坏其天然结构的修饰都固有地存在损害其内在向导效率的风险（Dong等人，2016；Swarts等人，2017）。因此，“抑制-恢复”方案可能会导致活性恢复不理想，潜在灵敏度损失可能需要补偿性的预扩增步骤，这构成了简便和稳健应用的关键瓶颈。在并行方法中，已设计出分裂型crRNA以促进多重检测（Chen等人，2024；Moon和Liu，2023）。然而，重组向导复合物通常对Cas12a表现出降低的结合亲和力，需要使用更高浓度才能达到可检测的活性，这构成了实现无核酸扩增检测所需高灵敏度的又一障碍（Shebanova等人，2022）。因此，迫切需要一种新的crRNA工程化策略。该策略必须能够实现高效的Cas12a激活，同时避免低效恢复和高工作浓度的需求，这对于构建无核酸扩增生物传感器至关重要。

在此背景下，脱氧核酶（DNA酶）提供了一种合适的工具。DNA酶是由催化核心和底物结合臂组成的催化性单链DNA寡核苷酸。它们能以高催化活性切割位点特异性核酸序列，用于信号放大（Jouha和Xiong，2021；Li等人，2022）。其主要特征之一是DNA酶活性依赖于特定金属离子。这使得非核酸的识别可以被转化为激活DNA酶的离子信号（Huang等人，2020）。因此，DNA酶可以作为检测多种非核酸目标的灵活信号转导平台（Ding等人，2023；Yan等人，2024）。此外，其固有的RNA切割活性和可编程性允许对crRNA进行变构调控，使DNA酶介导的crRNA工程化成为调控Cas12a活性的一种有前景的策略。此类条件性激活的一个关键设计步骤是工程化DNA酶的结合臂，使其与crRNA内互补的茎环区域匹配。这通常会引入可能干扰Cas12a在切割后识别和结合的工程化二级结构，从而可能损害核糖核蛋白（RNP）复合物组装并降低反式切割活性（Nguyen等人，2020b）。因此，合理的核酸设计对于最大限度减少结构干扰并确保DNA酶介导的切割后Cas12a功能的有效恢复至关重要。

在此，我们展示了一个高度灵敏的非核酸目标检测平台，其核心是为CRISPR-Cas12a设计的理性化DNA酶激活工程化crRNA（e-crRNA），并将其命名为DAE-CRISPR系统（图1）。e-crRNA通过将全长crRNA（crRNA₁）和分裂型crRNA（crRNA₂）序列嵌入发夹结构支架中构建而成，其中其间隔序列被茎区空间位阻阻挡。环部包含DNA酶识别的底物序列，将crRNA锁定在非活性（"关"）状态。加入Mn²⁺后，DNA酶被激活并切割e-crRNA，释放crRNA₁和crRNA₂。释放的crRNA₁直接结合cDNA₁，触发荧光-猝灭剂（FQ）标记的ssDNA报告分子初始Cas12a反式切割。同时，crRNA₂与预先设计的短crRNA（s-crRNA）组装，在cDNA₂上形成功能复合物。该复合物将Cas12a反式切割活性恢复至正常水平，完成向"开"状态的转变。我们系统的激活完全依赖于Mn²⁺。该离子既是必需的触发因素，也是将信号转化为可量化输出的基础。我们选择ALP和金黄色葡萄球菌作为代表性目标，利用DAE-CRISPR系统评估酶活性传感和适配体介导的全细胞检测。通过血清和牛奶中的ALP检测以及真实食品样本中的金黄色葡萄球菌检测评估了实际应用性。

章节摘要

实验部分

试剂和化学品、仪器和实验细节在补充材料中有描述。

DAE-CRISPR系统的原理验证

通过DNA酶激活的工程化crRNA实现Mn²⁺依赖性Cas12a激活。为精确控制Cas12a反式切割活性，我们设计了一种具有发夹结构的e-crRNA。该发夹在DNA酶介导的切割激活前受到空间位阻抑制。该e-crRNA包含一个自杂交茎区，阻断了间隔序列，防止Cas12a激活。环区作为Mn²⁺依赖性DNA酶的底物。加入Mn²⁺后，DNA酶切割了

结论

我们开发了基于DNA酶激活工程化crRNA（e-crRNA）的DAE-CRISPR生物传感平台。e-crRNA编码全长crRNA₁和分裂型crRNA₂，两者同时通过Mn²⁺依赖性DNA酶切割释放。crRNA₁/crRNA₂组合系统增强了Cas12a反式切割活性，实现了高效的活性恢复。合理的分裂位点设计提高了信噪比和Mn²⁺检测能力，而锁定的e-crRNA抑制了背景

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未引用参考文献

Stella等人，2018。

利益冲突

作者声明不存在竞争性的经济利益。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者感谢来自国家自然科学基金（批准号82473636、82504552和82674671）和“医学+X”交叉创新团队项目（批准号2025JBGS07）的资助。

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