基于机器学习的纳米体双模式免疫传感器，利用金-银纳米簇实现食品中弗莱克斯纳氏志贺菌（Shigella flexneri）的精准检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Machine learning-empowered nanobody-based dual-mode immunosensor using gold-silver nanoclusters for the accurate detection of Shigella flexneri in food

　　

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  首次获得了针对Shigella flexneri的特异性纳米抗体。
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  基于纳米抗体的双模式免疫传感器的荧光检测模式的灵敏度比比色模式高7.3倍。
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  机器学习（KNN + RF）实现了智能双信号融合，R²值为0.9953。
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  在猪肉、生菜和牛奶样本中获得了优异的回收率（81.53%–109.46%）。
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  一种用于检测食源性病原体的绿色、快速且无需设备的策略。

引言

近年来，食源性疾病的发病率上升成为全球主要的公共卫生问题（Li et al., 2022）。世界卫生组织估计，每年约有十分之一的人因食用受病原体污染的食物而生病，导致超过6亿人感染，约42万人死亡——其中近一半是由食源性病原体引起的，这凸显了在食品分发前进行严格检测的迫切需求（Castle et al., 2021）。Shigella flexneri（S. flexneri）是细菌性痢疾的主要致病菌，主要通过受污染的食物和水传播，由于其高传染性和低感染剂量而具有显著的爆发风险（Liang et al., 2022b）。鉴于S. flexneri对公共健康的严重威胁，开发适用于复杂食品基质的快速、准确的检测方法具有重要意义。尽管平板培养法仍是检测病原体的金标准，但其劳动密集型和耗时性限制了其在大规模快速筛查中的适用性。已经开发了基于MWCNT/壳聚糖和MWCNT/海藻酸钠复合电极的一次性电化学免疫传感器来检测S. flexneri，实现了低检测限（Zhao and Zhan, 2010; Zhao et al., 2011）。然而，这些方法依赖于复杂的电极修饰程序和专业电化学工作站，限制了它们在资源有限环境中的应用。另一方面，酶联免疫吸附测定（ELISA）由于其高特异性、灵敏度和高通量以及低成本而被广泛用于食品安全检测。然而，传统的ELISA检测S. flexneri受到两个主要因素的限制：难以获得高亲和力、高重复性和低成本的抗体，以及单信号输出容易受到干扰（Chen et al., 2025a; Yuan et al., 2026）。因此，迫切需要建立基于新型识别元素和创新信号输出策略的免疫测定方法，以便准确高效地检测食品中的S. flexneri。

抗体在免疫测定中至关重要，决定了其灵敏度和特异性（Zhang et al., 2025）。与多克隆和单克隆抗体相比，纳米抗体是从骆驼科动物重链抗体的可变域（VHH）中衍生出的最小天然抗体片段，具有显著优势（Li et al., 2023）。它们的制备简单且成本低廉，只需动物免疫后进行原核表达——避免了动物牺牲，并符合伦理标准（Zhang et al., 2024）。纳米抗体体积小且稳定性高，能够识别隐藏的表位，并适应复杂的检测环境（Sun et al., 2025）。它们的遗传可塑性使得可以通过与功能性蛋白融合来创建多功能探针，例如碱性磷酸酶、生物素、荧光素酶、GFP、多价蛋白和铁蛋白展示格式等（Liao et al., 2024; Liu et al., 2023; Lu et al., 2020; Song et al., 2024; Tang et al., 2018; Wang et al., 2020）。这些基于纳米抗体的策略为便捷检测食源性病原体提供了新的方向，并在食品安全领域显示出巨大潜力。尽管基于纳米抗体的免疫传感器已被广泛用于其他食源性病原体的检测，包括V. parahaemolyticus和L. monocytogene（Liu et al., 2026; Wang et al., 2023），但这些平台主要限于单信号输出（比色或荧光），并且容易受到环境干扰，缺乏内置的自验证功能。同时，近期的进展超越了病原体检测——例如使用钙钛矿标记的基于纳米抗体的夹心免疫传感器（January et al., 2025; January et al., 2026）——实现了超高灵敏度，但需要复杂的仪器和标记程序，限制了其在即时检测应用中的适用性。因此，开发针对S. flexneri的特异性纳米抗体并将它们与先进的信号输出策略整合起来，对于实现食品中这种病原体的快速准确检测具有巨大前景。

传统ELISA对食源性病原体的定量检测主要依赖于酶催化的比色信号。尽管操作简单且应用广泛，但其灵敏度有限，难以满足准确检测食源性病原体的要求。为了克服这一局限性，基于物理化学原理的各种信号放大策略的双模式检测平台已被广泛用于食源性病原体的检测，如F?rster共振能量转移（FRET）（Shan et al., 2023）、内部滤光片效应（IFE）（Luo et al., 2025）、聚集诱导发光（AIE）（Wan et al., 2021）和化学发光共振能量转移（CRET）（Xiong et al., 2020）。这些机制通过调节供体和受体之间的能量或电子转移有效提高了检测灵敏度。在荧光材料选择方面，常用的荧光材料包括天然荧光产物（Adhikari et al., 2016）、有机荧光染料（Wang et al., 2025）、量子点（Fu et al., 2020）和金属纳米簇（Wang et al., 2016）等。特别是金属纳米簇，由于其在光稳定性、低毒性和高生物相容性等方面的优势，已在分析领域得到广泛应用。值得注意的是，Au-Ag纳米簇已被成功用作生物传感和免疫传感应用中的荧光探针和信号放大标签（Pan et al., 2021; Yang et al., 2022; Zhang et al., 2022）。与单金属纳米簇相比，Au-Ag纳米簇具有更多优势：（1）金-银合金效应赋予它们更高的荧光量子产率和更宽的可调发射范围（Liu et al., 2020）；（2）它们可以在水介质中温和合成，无需有机溶剂或高温/高压设备，使制备过程简单且环保（Liu et al., 2021）。因此，BSA保护的金-银双金属纳米簇作为一种高性能的双功能信号探针，具有环保、光学性能优异且易于功能化的特点，是构建高灵敏度双模式免疫测定平台的理想选择，在快速食品安全检测领域具有广泛的应用前景。

在本研究中，开发了一种基于纳米抗体的双模式免疫传感器用于检测食品中的S. flexneri。构建了一个噬菌体展示的纳米抗体文库，并进行了生物淘选，成功获得了针对S. flexneri的特异性纳米抗体，随后对其进行了表达和纯化。所获得的纳米抗体表现出良好的热稳定性和优异的特异性。基于这些高特异性的纳米抗体，并结合Au-Ag纳米簇作为双模式信号探针，建立了比色-荧光双模式免疫传感器（图1）。同时，构建了一个机器学习模型来智能融合和校准双信号，进一步提高了检测的可靠性和准确性。通过将S. flexneri特异性纳米抗体、基于Au-Ag纳米簇的双模态探针和机器学习辅助的信号融合集成到单个平台中，这项工作具有以下优势：（1）作为识别元素的纳米抗体在低成本、优异的热稳定性和易于遗传工程方面优于传统单克隆抗体；（2）引入Au-Ag纳米簇实现了双模态信号交叉验证，确保了检测的可靠性；（3）机器学习辅助的信号融合和校准提高了处理后食品样本中的检测稳健性，使其适用于食品样本中S. flexneri的有效检测。

章节片段

材料和细菌菌株

本研究中使用的详细材料和设备列在支持信息中。

噬菌体展示纳米抗体文库的构建

按照已建立的协议（Zhang et al., 2023）构建了一个噬菌体展示的纳米抗体文库。用福尔马林灭活的S. flexneri与弗氏完全佐剂乳化后，通过多点皮下注射对一只健康的双峰骆驼进行免疫。随后每隔两周使用弗氏不完全佐剂进行四次额外免疫。最后一次免疫后：

噬菌体展示纳米抗体文库的构建

使用福尔马林灭活的S. flexneri悬浮液作为免疫原，对一只健康的成年双峰骆驼进行免疫（图1A）。如图1A所示，骆驼血清中的抗体滴度随着多次免疫而逐渐增加。第五次免疫后的抗体水平显著高于未免疫血清中的抗体水平，表明产生了足够的S. flexneri特异性纳米抗体，可以支持后续的筛查。

结论

在本研究中，构建了一个噬菌体展示的纳米抗体文库，并首次分离出了针对S. flexneri的特异性纳米抗体。使用这种纳米抗体作为捕获纳米抗体，以及噬菌体展示的纳米抗体作为检测纳米抗体，建立了一个双纳米抗体夹心免疫传感器，产生比色信号。此外，引入了Au-Ag纳米簇以产生荧光信号，实现了双模式检测。所提出的方法达到了最低的检测限

CRediT作者贡献声明

Xueyi Fan：撰写——原始草稿，实验研究，数据分析。Kai Zheng：可视化，数据分析。Mengnan Wang：实验研究。Guangsheng Ge：方法学。Yuxin Miao：数据管理。Qing Yao：软件开发。Pengyu Chen：实验研究。Min Ma：数据管理。Jianlong Wang：方法学。Yanru Wang：撰写——审稿与编辑，监督，资源协调。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（W2612024, 32472439）和陕西省重点研发计划（2026SF-YBXM-747）的资助。我们感谢西北农林大学生命科学学院生物实验教学中心的Guo Bing先生的技术支持。

Xueyi Fan|Kai Zheng|Mengnan Wang|Guangsheng Ge|Yuxin Miao|Qing Yao|Pengyu Chen|Min Ma|Jianlong Wang|Yanru Wang