《Journal of Tissue Engineering》：Advances in in vitro modeling of skeletal muscle injury, dysfunction, and repair: From conventional cultures to functional microphysiological systems
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骨骼肌损伤涉及炎症、肌源性激活、细胞外基质（ECM）重塑和功能恢复之间的复杂相互作用。然而，传统模型往往无法重现人类损伤反应和再生过程。近年来，生物材料、生物制造和微生理系统（MPS）的进展使得更具生理相关性的体外肌肉平台成为可能。本综述总结了从二维（2D
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骨骼肌损伤涉及炎症、肌源性激活、细胞外基质（ECM）重塑和功能恢复之间的复杂相互作用。然而，传统模型往往无法重现人类损伤反应和再生过程。近年来，生物材料、生物制造和微生理系统（MPS）的进展使得更具生理相关性的体外肌肉平台成为可能。本综述总结了从二维（2D）培养到工程化三维（3D）肌肉组织和微生理系统的演变过程，重点阐述了支架组成、组织架构、生物物理刺激和多细胞整合如何影响肌肉成熟、损伤反应和修复。我们区分了损伤与功能障碍、结构恢复与再生及功能恢复、保护性干预与损伤后修复之间的差异。我们讨论了当前用于化学性、氧化性、机械性、电性、炎症性、代谢性和药物诱导的肌肉损伤与功能障碍模型。一个分阶段评估框架整合了结构、分子、代谢和功能读数，涵盖基线表征、损伤或功能障碍评估以及后续恢复。最后，我们提出了一个决策矩阵，将损伤机制与模型设计和功能评估相匹配，以提高可重复性、可解释性和转化相关性。
论文主体内容总结：
1. 引言
骨骼肌再生是一个受炎症信号、肌源性祖细胞激活和损伤后细胞外基质（ECM）动态重塑协调调控的严密过程。该协调过程的失败可导致功能恢复不完全、过度纤维化或慢性肌肉退变。动物模型虽不可或缺，但存在物种差异和实验可控性有限等问题。传统二维（2D）培养系统虽操作简便、适合高通量筛选，但缺乏三维（3D）结构、生物力学线索及神经、血管和免疫等关键微环境组分。相比之下，3D工程化骨骼肌通过几何约束和生物物理线索支持肌纤维组织和功能成熟，整合内皮细胞可研究血管-肌源性相互作用，纳入巨噬细胞可支持免疫介导的肌肉修复研究。微生理系统（MPS）通过微流体灌注支持营养和氧气输送，实现生化线索和病理刺激的时空调控，可支持收缩力、电生理活动和代谢反应的实时或纵向测量，为研究人类相关肌肉损伤机制、慢性功能障碍、修复及治疗反应提供了有力框架。
2. 体外骨骼肌模型的演变：从二维培养到微生理系统
2.1 二维单层培养
二维成肌细胞培养广泛用于研究肌源性分化和初步药物筛选，其简单构型便于实验操作、成像和相对高通量分析。然而，传统单层培养难以长期维持，无法重现天然三维组织架构或组织水平的机械负荷。工程化平面培养策略如微模塑明胶水凝胶、单轴褶皱石墨烯基底和几何微图案化ECM表面可引导成肌细胞排列和融合，促进肌管成熟和肌节组织化，但仍受限于重现体积架构和组织水平力传递的能力。
2.2 类器官模型
骨骼肌类器官通常由多能干细胞通过自组织和发育模式化生成，允许多细胞结构在有限外部几何约束下形成。与工程化肌肉组织不同，类器官主要依赖内在细胞间相互作用和发育程序，特别适用于研究人类肌肉发育、谱系特化和疾病相关表型。许多人类多能干细胞来源的骨骼肌类器官保留胚胎或胎儿特征，结构及功能成熟度不一。其新兴应用包括毒素诱导损伤和细胞因子诱导肌肉萎缩的研究，但细胞组成和分化方案的变异性、血管化不完全及功能评估不一致限制了可重复性和跨研究比较。
2.3 三维工程化骨骼肌与微生理系统
三维工程化骨骼肌模型使用水凝胶、纤维支架或微结构化生物材料在组织样环境中支持肌源性细胞。几何约束和机械锚定促进细胞纵向排列、肌管融合和组织水平张力发展，相比传统平面培养具有更好的结构组织和功能成熟度。该类模型的主要优势在于可控制组织几何、基质组成和机械边界条件，同时直接评估收缩行为。肌肉芯片平台属于骨骼肌微生理系统的更广泛类别，利用微加工装置在受控微环境中组织肌肉细胞或组织，可整合微流体灌注、电或机械刺激及集成传感器，支持收缩力、钙动力学、代谢活性和分泌反应的纵向或实时测量。
3. 工程化骨骼肌损伤反应性和修复能力的工程决定因素
3.1 细胞组分决定损伤反应性和再生潜力
细胞来源决定工程化骨骼肌模型的生物学范围、可重复性和适用性。原代人类肌源性细胞保留供体特异性特征，通常具有稳健的分化能力，但供体间变异性和有限扩增能力是标准化和规模化比较研究的主要挑战。永生化成肌细胞系如鼠源C2C12细胞提供高度可重复和可扩展的平台，但其非人类来源和未成熟发育特征限制了对成人人类骨骼肌生理的直接外推。诱导多能干细胞（iPSC）来源的肌源性细胞可实现患者特异性和基因型特异性建模，但成熟不完全和分化效率变异仍是重要局限。支持细胞群体的纳入应根据具体生物学问题决定：基质细胞在ECM重塑、纤维化或适应不良修复为主要结局时尤为重要；免疫组分尤其是巨噬细胞在炎症启动、碎片清除、消退过程或肌源性反应调控为核心目标时不可或缺；内皮和血管周细胞在缺氧、代谢应激或长期重塑相关损伤范式中发挥作用；神经组分在神经肌肉传递、兴奋-收缩耦联或去神经相关功能障碍为关键结局时最具价值。
3.2 生物材料特性调控组织成熟和损伤反应
生物材料提供结构支持和生化线索，调控分化、ECM重塑和力传递。纤维蛋白、胶原蛋白和基底膜来源基质通过不同的细胞-基质相互作用支持成肌细胞融合和组织组织化。基质组成和浓度直接影响构建体的组织化、力学性能、钙处理和收缩力。基质刚度、弹性和粘弹性通过机械转导通路调控细胞骨架组织化、肌节组装和收缩成熟。材料重塑动力学在纵向恢复研究中尤为重要：过度降解可能损害结构完整性，而过度持久可能限制细胞迁移和内源性基质沉积。合成或修饰基质为独立调节力学性能、降解行为和生化呈现提供了机会，所选重塑时间尺度应与恢复期匹配，同时保持足够机械稳定性以支持重复功能评估。
3.3 组织架构和生物物理条件化建立基线功能和损伤易感性
组织架构决定工程化骨骼肌的基线机械能力，从而塑造其对后续损伤的反应。定向组织化促进肌管排列和肌节组装，而柔性柱或肌腱样附着提供被动张力和明确的机械边界条件。机械和电条件化可增强基线组织成熟，但每种干预在应用不当时也可能作为潜在损伤刺激。循环机械负荷在生理条件下促进肌纤维排列、组织生长和基质重塑，而过度应变或长时间负荷可能损害细胞完整性并降低收缩性能。电刺激改善钙处理、肌节组织和力生成，但过度刺激频率、振幅或持续时间可能诱导疲劳或损伤。灌注影响营养转运、氧可用性、代谢物清除和可溶性损伤因子的有效暴露。功能易感性应通过定量测量而非仅从形态学变化推断，相关参数包括损伤阈值、力降低、抗疲劳性、钙处理改变、恢复幅度和恢复动力学。归一化至损伤前功能表现有助于区分真实损伤反应与基线组织成熟差异。
3.4 将工程决定因素整合到模型选择中
模型复杂性仅在引入必要且可测试的特征时才具有合理性。应根据生物学问题、所需损伤机制、工程复杂性、功能终点和预期转化声明选择合适的模型。这种从设计到问题的方法允许工程选择界定实验范围，同时防止将模型复杂性误认为生物学有效性。工程复杂性应被视为重现特定生物学过程的手段，而非模型优越性的内在度量。
4. 骨骼肌损伤、功能障碍和修复的体外建模
4.1 骨骼肌损伤和修复的生物学基础
4.1.1 骨骼肌损伤和修复概述
本综述中，损伤指可证实的细胞或组织损害，如肌膜破坏、肌纤维碎裂或细胞死亡。功能障碍指收缩、电生理或代谢性能受损，可能伴有或不伴有明显结构损伤。恢复指先前受损终点部分或完全改善至基线或对照水平。结构恢复指肌管形态或组织组织化的改善。再生需要损伤后新肌纤维形成或祖细胞介导的肌纤维重建的证据。功能恢复需要直接测量的肌肉性能改善，如收缩力、抗疲劳性或兴奋-收缩耦联。治疗性拯救指损伤或功能障碍确立后干预介导的改善。在天然骨骼肌中，再生涉及炎症反应、肌源性祖细胞激活和ECM重塑的协调过程，包括初始炎症期、肌源性期和成熟重塑期。
4.1.2 修复结局的多细胞和分子调控
天然骨骼肌中，卫星细胞是负责再生的主要驻留干细胞群体。损伤后，部分细胞保留干性以补充卫星细胞池，其他细胞被激活生成肌源性祖细胞。体内免疫和基质细胞在肌肉修复中发挥时间协调且背景依赖的效应：中性粒细胞快速聚集参与碎片清除并释放ROS和炎症介质；巨噬细胞随后从炎症性向修复性状态转变，支持炎症消退、卫星细胞活性和肌源性分化；纤维脂肪祖细胞（FAPs）被瞬时激活，参与ECM重塑和结构支持，但持续炎症或FAP激活失调可损害肌源性再生并促进过度基质沉积。这些细胞相互作用由Notch、Wnt/β-catenin、转化生长因子-β（TGF-β）/Smad、胰岛素样生长因子1（IGF-1）/Akt/雷帕霉素机制靶点（mTOR）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38-MAPK）等信号通路协调调控。
4.2 急性骨骼肌损伤和功能障碍模型
4.2.1 化学诱导损伤模型
传统2D肌源性培养中，氯化钡（BaCl?）提供简单可重复的选择性肌管损伤方法。BaCl?暴露消除分化的多核C2C12肌管而基本保留单核细胞群体，去除刺激后存活细胞恢复肌源性分化并形成新肌管，但形态恢复不完全且未评估收缩恢复。人多能干细胞来源的骨骼肌类器官用于模拟心脏毒素（CTX）诱导损伤，白细胞介素-4（IL-4）处理增加损伤后MYOG阳性肌细胞比例。工程化3D骨骼肌模型可同时检查基质环境和再生细胞群体对修复的贡献：胶原/Matrigel构建体在BaCl?损伤后第4天恢复电诱发力量；原代人类工程化肌肉中MyoD阳性细胞瞬时增加先于第9天力量恢复至对照水平，肌管大小在第14天恢复，表明结构和功能恢复可遵循不同时间进程。蜂毒肽诱导的肌纤维碎裂和收缩功能障碍伴随静息PAX7阳性卫星样细胞再激活。CTX损伤后人类多能干细胞来源工程化肌肉第21天恢复损伤前强直力的57±8%，照射消除力量恢复和新纤维形成。成年大鼠工程化肌肉中，骨髓来源巨噬细胞的纳入支持CTX损伤后的肌生成和力量恢复。肌肉微生理系统将化学损伤诱导与受控组织几何和定量监测相结合。
4.2.2 氧化应激诱导损伤模型
氧化应激损伤模型重现过量活性氧（ROS）积累、氧化还原失衡和线粒体功能受损引起的骨骼肌损伤。根据氧化剂暴露的强度和持续时间，可产生从亚致死代谢和细胞骨架功能障碍到明显肌管碎裂和细胞死亡的响应谱。2D C2C12肌管培养中，过氧化氢（H?O?）暴露1小时后细胞刚度呈增加趋势，2和24小时后刚度降低。表面定向组织雕刻策略生成各向异性人类骨骼肌组织，H?O?暴露增加ROS积累并降低柠檬酸合酶活性，表明氧化损伤相关的线粒体功能障碍。PARP抑制剂奥拉帕尼和维利帕尼及维甲酸联合二十碳五烯酸（EPA）在H?O?暴露前给药具有保护作用。可拉伸微流体C2C12肌管模型中，损伤后应用循环拉伸增加肌管直径和肌球蛋白重链表达，减少氧化应激和DNA损伤。
4.2.3 机械损伤模型
机械损伤模型重现超过肌肉组织适应能力的过度压缩、变形或拉伸引起的骨骼肌损伤。3D工程化骨骼肌模型中，受控压缩用于重现压力相关肌肉损伤：轴向压缩诱导局部细胞死亡，随应变幅度和加载持续时间增加而增加。微流体平台提供更精确的机械加载控制：过度轴向拉伸诱导ROS积累、肌管直径和肌球蛋白重链表达降低及氧化DNA损伤增加。分阶段肌肉芯片模型中，高强度机械刺激诱导细胞损伤，随后低强度刺激促进细胞骨架重组和肌管形成，将机械损伤建模扩展至包含明确的损伤后修复阶段。
4.2.4 电过度刺激诱导损伤和功能障碍模型
电刺激对工程化骨骼肌产生参数依赖性效应。适当校准的刺激可促进组织成熟和收缩活动，而过度的刺激振幅、频率或持续时间可能诱导代谢应激、电化学损伤或收缩相关功能损害。2D系统中，高频电刺激诱导细胞内ROS积累和ROS依赖性磷酸戊糖途径激活。3D工程化骨骼肌中，急性刺激在电场振幅超过约六倍组织基强度时增加半松弛时间和疲劳性，而增加脉冲能量不产生相当的有害效应，表明过度电场振幅是刺激诱导功能损害的主要决定因素。患者来源的杜氏肌营养不良症肌肉组织中，持续电诱发收缩诱导肌膜损伤和疲劳样强直表型，证明肌营养不良蛋白缺陷肌肉对收缩相关损伤的易感性增加。
4.3 慢性骨骼肌功能障碍及相关损伤模型
4.3.1 慢性代谢功能障碍模型
持续代谢应激可损害肌源性分化、破坏代谢稳态并逐渐降低骨骼肌功能。2D培养中，晚期糖基化终末产物（AGEs）长期暴露损害C2C12分化和肌管形成，增加衰老相关标志物并降低肌肉特异性蛋白表达。3D骨骼肌微生理系统中，持续AGE暴露诱导肌管萎缩、收缩损害、凋亡信号和代谢失调，转录组分析和荧光寿命成像揭示代谢和结构稳态的破坏。更复杂的微生理系统可重现与代谢疾病相关的脂肪-肌肉旁分泌串扰：发炎脂肪细胞-巨噬细胞共培养的暴露降低肌束收缩性并诱导代谢重编程，包括脂肪酸转运和胰岛素抵抗相关转录变化。
4.3.2 慢性炎症诱导功能障碍模型
持续炎症信号破坏骨骼肌合成代谢和分解代谢通路的平衡，导致肌源性分化受损、进行性肌纤维萎缩和功能衰退。2D培养中，肿瘤坏死因子α（TNF-α）持续暴露诱导肌管变薄、活力降低、萎缩相关标志物表达增加和肌源性调控程序抑制。人PSC来源骨骼肌类器官中，TNF-α持续暴露诱导肌肉消耗，急性挑战可评估祖细胞激活、增殖、分化和肌纤维大小恢复。3D工程化肌肉组织中，TNF-α暴露诱导时间依赖性收缩力下降伴肌管萎缩，快肌肌管对炎症刺激的易感性更高。干扰素γ（IFN-γ）长期暴露诱导明显肌管萎缩、肌节紊乱、钙处理受损、JAK-STAT1信号激活和分泌谱广泛改变，运动模拟电刺激同时应用可减轻肌肉消耗和收缩缺陷。血管化肌肉芯片平台整合肌源性细胞、内皮细胞和单核细胞，免疫激活诱导肌纤维萎缩和肌肉成熟标志物表达降低。
4.3.3 药物诱导损伤和功能障碍模型
临床相关药物长期暴露可诱导进行性肌纤维萎缩、代谢功能障碍、结构退变和收缩性能受损。3D工程化肌肉组织已用于表征不同药物毒性模式：阿托伐他汀暴露诱导剂量和时间依赖性力损失及肌纤维坏死；西立伐他汀诱导肌管萎缩和收缩损害，增加骨骼肌肌钙蛋白I（sTnI）、肌酸激酶（CKm）和脂肪酸结合蛋白3（FABP3）释放；地塞米松也引起萎缩和力损失但降低这些生物标志物释放。连续他汀暴露诱导进行性收缩下降、肌纤维碎裂和肌节α-肌动蛋白组织破坏。药代动力学模拟人肌束模型中，紫杉烷暴露改变微管稳定性、底物利用、线粒体功能和疲劳动力学，尽管对峰值力影响相对有限。96孔兼容MyoTACTIC平台结合无创力测量和钙瞬变成像，识别地塞米松、他汀和化疗药物的药物特异性功能反应。
4.4 损伤、功能障碍和恢复的多尺度评估
4.4.1 结构和细胞表征
结构和细胞表征提供基线组织成熟度、损伤程度和后续再生反应的基础信息。基线成熟度可通过肌管直径、排列、融合指数、肌节组织化和肌球蛋白重链等收缩蛋白表达评估。损伤后，肌膜破坏、肌纤维碎裂、细胞死亡、收缩蛋白丢失和组织架构紊乱可用于评估损伤严重程度。结构恢复通过肌管形态、肌节组织化和ECM组织化的改善评估。再生通过新肌管形成或祖细胞介导肌纤维重建的证据评估。免疫荧光染色用于评估肌纤维结构、肌源性细胞状态、核组织化和增殖活性，定量图像分析实现肌管均匀性、融合指数、排列和空间组织的客观测量。
4.4.2 收缩和电生理评估
与常规2D培养相比，工程化3D肌束可实现组织水平力生成、力传递和疲劳行为的更直接评估。柔性微柱、光学变形追踪和集成力传感系统可量化单收缩力、强直力、比张力、抗疲劳性及收缩和松弛动力学。钙瞬变成像和电生理测量进一步表征兴奋-收缩耦联、收缩同步性、膜兴奋性和电刺激阈值。损伤-修复研究中，收缩力、钙处理和抗疲劳性的纵向恢复比单独形态学测量提供更强的功能恢复证据。
4.4.3 分子和代谢分析
分子分析通过识别损伤和恢复相关信号通路和细胞程序补充结构和功能评估。转录组和其他组学分析可表征肌源性分化、炎症信号、氧化应激、蛋白质分解代谢、ECM重塑和再生通路激活。代谢读数包括葡萄糖和乳酸通量、氧消耗等，提供损伤和恢复过程中的代谢状态信息。
