颞下颌关节支配三叉神经元中压电致动器诱发的机械门控电流

《Molecular Pain》：Piezoelectric actuator-evoked mechano-gated currents in trigeminal neurons innervating the mouse temporomandibular joint

　　

颞下颌关节紊乱病（TMJDs）最令人困扰的症状是机械性诱发疼痛。为鉴定介导机械敏感性的三叉神经节（TG）神经元亚型，研究人员将全细胞膜片钳电生理学与免疫组织化学（IHC）相结合，对经颞下颌关节（TMJ）逆行标记的小鼠TMJ支配TG神经元进行了表征。电生理分析鉴定出五个不同的神经元群，其中仅有一群对压电致动器诱导的机械刺激产生反应。TMJ神经支配以C型和A型伤害感受器为主，占所鉴定五群中的四群。第五群为少量小直径神经元（S1），其特性与vGlut3阳性C型低阈值机械感受器（C-LTMRs）或Sst阳性神经元一致。两群机械不敏感的C型伤害感受器可根据其动作电位放电模式加以区分，可能分别对应于CGRP阳性和非Mrgpr神经元群。一群机械不敏感的A型伤害感受器可能代表Smr2阳性Aδ型高阈值机械感受器（Aδ-HTMRs）。唯一具有机械反应性的神经元为大直径A型伤害感受器，可能对应于弱TrkC表达神经元群。所记录神经元中无一呈现经典A-LTMRs的电生理特征。综上，这些发现表明，与皮肤和咬肌相比，TMJ由一组独特的三叉神经节感觉神经元支配，其中机械反应性传入纤维仅限于单一A型伤害感受器亚型，而非经典的低阈值机械感受器。

一、研究背景与科学问题

颞下颌关节紊乱病（Temporomandibular joint disorders, TMJD）是一组影响颞下颌关节（TMJ）及相关结构的异质性疾病，其最常见且最令人困扰的症状是疼痛，这种疼痛可自发产生，也可由下颌运动、关节弹响、试图克服张口受限以及关节锁定等过程中的机械刺激所诱发。目前TMJD疼痛的治疗效果仍不理想，原因在于对TMJ疼痛机制的认识有限。当保守治疗（如咬合干预和抗炎药物）无效时，往往需要采用有创手段，包括关节镜手术和全关节置换等，但这些方法常只能提供不一致或不完全的疼痛缓解。此外，TMJ结构退变程度与患者疼痛严重程度之间的相关性较弱，提示支配TMJ的感觉神经元功能改变（而非单纯的关节病理变化）可能在TMJD相关疼痛中发挥关键作用。由于TMJD疼痛通常因关节的机械负荷而加重，TMJ支配感觉传入纤维的异常机械感觉信号传导很可能是疾病相关疼痛的关键机制。

TMJ由三叉神经节（trigeminal ganglion, TG）下颌支发出的感觉传入纤维支配，包括耳颞神经、咬肌神经、颞深神经和关节神经四个外周分支。既往研究表明，小鼠TMJ感觉神经支配主要由CGRP⁺/Htr3a⁺肽能伤害感受器组成，约70%的TMJ神经为无髓C纤维，其余30%为有髓A纤维。耳颞神经的细胞外记录进一步显示，TMJ传入纤维包含约12%的Aδ高阈值机械感受器（Aδ-HTMRs）、12%的C纤维高阈值机械感受器（C-HTMRs）、36%的Aδ多觉伤害感受器和39%的C纤维多觉伤害感受器。这些发现表明TMJ主要由特化编码伤害性机械刺激的伤害感受性传入纤维支配，这与TMJD的机械诱发疼痛特征一致。然而，TMJ特异性支配的TG神经元的固有机械反应性此前尚未被充分阐明。因此，本研究旨在利用压电驱动机械刺激器，通过直接膜位移来确定TMJ支配TG神经元的不同群体是否具有机械激活特性。

二、研究内容与主要结论

研究人员采用小麦胚芽凝集素（WGA）逆行示踪技术结合全细胞膜片钳电生理记录和免疫组织化学（IHC），对50个经质量控制标准筛选的TMJ支配TG感觉神经元进行了系统表征。电生理分析依据动作电位波形、重复放电特性、机械激活电流（MA currents）的有无以及外向电流动力学四个标准，将TMJ支配TG神经元划分为五个电生理学上截然不同的群体（S1、S2、S3、M1和M2）。研究得出以下核心结论：TMJ神经支配以C型和A型伤害感受器为主，其中仅M1群体（大直径A型伤害感受器）对压电致动器诱导的机械刺激产生反应，其MA电流呈慢适应动力学特征（τ约200 ms），激活阈值约9 μm，峰值电流幅度在200至1500 pA之间。这一发现表明TMJ的机械反应性传入纤维仅限于单一A型伤害感受器亚型，而非经典的低阈值机械感受器，揭示了TMJ与皮肤和咬肌在感觉神经支配模式上的显著差异。

三、主要关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：其一，小鼠TMJ关节腔内注射WGA-Alexa Fluor 488结合甲苯胺蓝可视化标记，实现TMJ支配TG神经元的逆行示踪；其二，TG神经元原代培养后进行全细胞膜片钳电生理记录，在电压钳和电流钳模式下测量动作电位特性、重复放电模式、机械激活电流和外向电流动力学；其三，压电致动器驱动的机械刺激系统，通过直接膜位移诱发机械门控电流；其四，免疫组织化学结合转基因报告小鼠系（TrkC^Cre-ER-TdTom和Smr2^Cre-TdTom）对TMJ各结构（关节囊、前盘和盘后组织）中vGlut3、TrkC和Smr2阳性神经纤维进行定量分析。实验动物为10至25周龄的C57BL/6小鼠，来自Jackson Laboratory。

四、研究结果

TMJ TG C型伤害感受器和小直径神经元： 21个WGA⁺ TG神经元呈现典型C型伤害感受器特征，包括复极化期有明显隆起的宽大动作电位。根据1秒去极化电流注射期间的放电模式，C型伤害感受器被分为两个亚群：S2亚群产生单个动作电位而无持续放电，S3亚群则以3至28 Hz的频率重复放电。两个亚群均对压电致动器机械刺激无反应。此外，4个WGA⁺小直径神经元呈现相对笔直的动作电位波形，被归为S1群体，其特性与Sst⁺或vGlut3⁺ C型低阈值机械感受器（C-LTMRs）一致，但仅1个S1神经元记录到MA电流，无法对该群体进行明确的功能分类。

TMJ TG A型伤害感受器： 25个WGA⁺神经元呈现显著更窄的动作电位基宽（dB），复极化期有轻微偏转，上升期有明确的起始拐点，符合NFH⁺/CGRP⁺ A型伤害感受器的特征。根据机械刺激反应性，A型伤害感受器被分为两个功能不同的亚群：M1神经元产生机械激活电流，呈慢适应动力学（τ约200 ms），激活阈值约9 μm，峰值电流幅度在200至1500 pA之间；M2神经元则机械不敏感。此外，M1神经元表现出更明显的外向电流峰值，而M2神经元的外向电流峰值相对较小。MA电流仅在M1亚群中被检测到，表明TMJ TG神经元的机械敏感性仅限于这一特定的A型伤害感受器群体。

TMJ TG神经元的电生理特性： 膜电容在各组间无统计学显著差异，但M1和M2群体的平均值较大且变异度较高。外向电流动力学在各组间总体相似，唯一例外是S1群体呈现较慢的外向电流衰减且缺乏其他群体中明显的瞬时外向电流成分。静息膜电位（RMP）方面，M1和M2神经元比S1-S3神经元更负。动作电位基宽（dB）是区分TMJ TG神经元亚型最清晰的参数之一：S1和S2神经元动作电位最宽，而M1和M2神经元显著更窄。AHP₈₀在S3群体中显著延长，表明其动作电位后恢复较慢。M1和M2群体的基强度（rheobase）显著高于S1-S3神经元，表明在膜片钳条件下A型伤害感受器激活需要更强的刺激强度。

TMJ中vGlut3神经的标记： 鉴于S1神经元可能对应于Sst⁺神经元或vGlut3表达的C-LTMRs，且既往分析显示Sst⁺神经元在TMJ中占比不足5%，研究人员使用vGlut3作为C-LTMRs的特异性标记进行IHC分析。结果显示vGlut3阳性纤维在TMJ各结构（关节囊、前盘和盘后组织）中均有分布，但相对稀少，约占NFH阳性纤维的5-20%，占Pgp9.5阳性感觉纤维总数的不到7%，证实该神经元群在TMJ感觉支配中占比较小。

TMJ中TrkC神经的解剖： 为探讨A-LTMRs是否参与TMJ神经支配，研究人员使用TrkC^Cre-ER-TdTom小鼠分析了TrkC表达。定量分析显示，关节囊和盘后组织中约20%的NFH⁺纤维表达TrkC，前盘中该比例增至约40%。但TrkC阳性纤维仅占所有TMJ结构中Pgp9.5阳性感觉纤维总数的不到20%，且TMJ中TrkC阳性纤维的荧光信号相对较弱，表明TrkC在TMJ感觉纤维中表达水平较低，为经典A-LTMRs在TMJ中的存在提供的支持有限。

TMJ中Smr2神经的解剖： 鉴于M2神经元可能是Smr2⁺ Aδ-HTMRs的候选群体，研究人员使用Smr2^Cre-TdTom小鼠分析了Smr2表达。结果显示Smr2阳性纤维在TMJ中广泛分布，约占所有TMJ组织中NFH阳性纤维的80%，并与60-80%的CGRP阳性纤维共定位，表明大多数有髓肽能感觉纤维表达该标记物。结合Smr2⁺传入纤维在体内需要强刺激才能被机械激活的已知特性，这一群体被认为是电生理鉴定的机械不敏感M2 TMJ TG神经元的有力候选。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究产生了多项重要发现。第一，TMJ支配神经元与既往报道的咬肌（MM）支配感觉神经元的电生理特性比较表明，TMJ和MM的感觉神经支配模式截然不同：MM主要由有髓纤维和A型伤害感受器支配，而TMJ以C型伤害感受器为主，强调了对个体颅面结构进行独立研究而非跨组织外推的重要性。第二，结合既往TMJ神经支配的IHC表征和TG细胞图谱，所记录的C型伤害感受器最可能对应于CGRP⁺/Dcn⁺、CGRP⁺/Adra2a⁺和/或CGRP⁺/Opkrt1⁺神经元亚型中的一种或多种。第三，S1小直径神经元群可能对应于Sst⁺和vGlut3⁺神经元群的混合，两者在TMJ组织中的感觉支配占比均较小（<5-7%），但由于S1神经元数量有限，无法通过机械反应性进行明确的功能区分。第四，IHC分析表明TMJ A纤维中相当比例为Smr2⁺，鉴于Smr2阳性传入纤维的机械反应难以诱发，机械不敏感的M2群体很可能是对应于Aδ-HTMRs的Smr2⁺ TG神经元。第五，所记录神经元中无一可靠呈现A-LTMRs的电生理特性，与经典A-LTMR标记物（parvalbumin和TrkC）在TMJ感觉神经中缺失或极低表达一致，M1群体的功能身份仍不确定，可能代表 elusive 的Aβ高阈值机械感受器（Aβ-HTMR）群体。

研究结论为：TMJ由一组与皮肤和咬肌不同的独特TG感觉神经元支配，TMJ神经支配以C型和A型伤害感受器为主，机械反应性传入纤维仅限于单一A型伤害感受器亚型（M1），而非经典的低阈值机械感受器。这一发现为理解TMJD机械性疼痛的细胞机制提供了重要基础，提示针对特定A型伤害感受器亚型的靶向干预可能为TMJD疼痛治疗提供新的策略。