《Sage Open Medicine》：Variations of pre-miR-938, pre-miR-618, HOXA11-AS, and HULC genes and the risk of prostate cancer in an Iranian population: A case-control study with in-silico analysis
编辑推荐：
摘要
前列腺癌（prostate cancer, PCa）是男性中第二常见的恶性肿瘤，给患者和医疗系统带来沉重负担。由于当前的诊断/筛查检测缺乏最佳特异性，已有多种生物标志物被引入以弥补这一不足。微小RNA（microRNA, miRNA）和长链非编码RNA（
摘要
前列腺癌（prostate cancer, PCa）是男性中第二常见的恶性肿瘤，给患者和医疗系统带来沉重负担。由于当前的诊断/筛查检测缺乏最佳特异性，已有多种生物标志物被引入以弥补这一不足。微小RNA（microRNA, miRNA）和长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）即属于此类生物标志物，其在前列腺癌中可能出现表达失调。因此，本研究旨在探讨这些RNA与伊朗人群中前列腺癌风险之间的关联。
采用病例对照研究设计，研究人员比较了前列腺癌患者与无癌对照者之间pre-miR-938 rs2505901、pre-miR-618 rs2682818、HOXA11-AS rs17427875及HULC rs7763881变异的差异，并进行了初步的生物信息学分析（in-silico analysis）以提出可能的机制假说。
结果显示，pre-miR-938（rs2505901）T>C变异和HOXA11-AS（rs17427875）A>T变异在任何遗传模式下均未显示与前列腺癌风险存在显著关联。rs2682818 C>A变异除显性遗传模式外，与前列腺癌风险增加相关；而HULC（rs7763881）A>C变异在显性和等位基因模式下与风险降低相关。基于生物信息学分析产生的假说，rs2682818和rs17427875分别导致SRp30c和SRp20预测结合位点的获得；另一方面，rs2682818导致异质核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, hnRNP）H1、H2、H3及F预测结合位点的丢失。rs2505901导致SC35预测结合位点的丢失，同时获得hnRNP A1、H3、F、SRp40及锌指Ran结合域蛋白2（zinc finger Ran-binding domain-containing protein 2, ZRANB2）的额外结合位点。最后，研究人员探讨了由miR-938和miR-618调控的靶基因及其功能。
这些变异与前列腺癌风险的关联强调了开发基于人群的生物标志物并进行后续外部验证以实现潜在临床应用的重要性。此外，生物信息学分析为所检测到的关联中可能涉及的分子机制提供了假说，有待进一步的分子研究加以验证。
论文解读：伊朗人群中非编码RNA基因变异与前列腺癌风险的关联研究
一、研究背景与问题
前列腺癌（prostate cancer, PCa）是全球男性第二常见的恶性肿瘤，其发病率随年龄增长而持续上升。在伊朗，前列腺癌的年龄标准化发病率呈显著上升趋势，2023年该国的国家经济负担估计达2.17亿美元，31%的受影响个体面临灾难性卫生支出。尽管新型筛查和诊断生物标志物不断涌现，但常用的检测手段如前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen, PSA）仍缺乏足够特异性。前列腺癌是最具遗传性的癌症之一，遗传因素约占其风险的52%至63%，因此遗传变异可能为评估个体易感性、指导治疗干预和个体化管理策略提供依据。
人类约98%的RNA转录本为非编码RNA，包括长度超过200个核苷酸的长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）和约20个核苷酸大小的微小RNA（microRNA, miRNA）。非编码RNA基因内的单核苷酸变异（single nucleotide variant, SNV）备受关注，因为这些RNA通过基因表达调控和转录后调控等机制参与广泛的细胞过程。miRNA主要通过调节靶信使RNA（messenger RNA, mRNA）的稳定性或翻译效率来调控基因表达，而lncRNA则通过多种机制发挥作用，包括充当分子信号或调控因子的诱饵、调节miRNA活性、引导染色质修饰复合物、为核糖核蛋白组装提供支架以及干扰RNA加工等。
尽管miR-938、miR-618、HOXA11-AS和HULC等非编码RNA中的SNV已被报道与多种癌症相关，但现有数据存在不一致，且这些变异在前列腺癌中的作用尚不明确。例如，miR-938 rs2505901变异在多项研究中显示对多种癌症具有保护作用，但另一项研究未发现其与胃癌易感性或预后相关；miR-618 rs2682818变异与乳腺癌相关，但在结肠癌中却与较低风险相关。此外，虽然关于前列腺癌的全基因组关联研究不断增多，但大多数研究缺乏中东男性的数据。因此，本研究旨在扩展伊朗人群样本中与前列腺癌相关的遗传变异文献，探讨pre-miR-938 rs2505901、pre-miR-618 rs2682818、HOXA11-AS rs17427875和HULC rs7763881变异与前列腺癌风险之间的关联。
二、研究设计与方法
研究人员开展了一项单中心病例对照研究，纳入2017年至2020年间194例经组织学确诊并接受开放性前列腺切除术的前列腺癌患者，以及240例因良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia, BPH）接受经尿道前列腺切除术或开放性前列腺切除术的无癌对照者。对照组的无恶性病变通过术后标本的病理检查进一步确认。病例纳入标准包括：基于手术标本的病理学确认的前列腺腺癌、诊断时年龄≥40岁、具有伊朗国籍、愿意参与以及具有完整的临床和病理数据（包括PSA水平、Gleason评分、肿瘤分期、神经周围侵犯状态和手术切缘状态）。排除标准包括既往有其他恶性肿瘤病史、样本采集前接受过放疗、化疗或激素治疗、存在其他前列腺病理以及临床数据不完整或DNA样本质量不足。对照组的排除标准包括前列腺癌或高级别前列腺上皮内瘤变的病理学证据、既往恶性肿瘤史、既往前列腺手术、放疗或激素治疗、急慢性前列腺炎以及数据不完整或DNA质量不足。
受试者招募自伊朗德黑兰沙希德·贝赫什提医科大学沙希德·拉巴菲内贾德医疗中心泌尿外科。研究经扎黑丹医科大学伦理委员会批准（批准号：IR.ZAUMS.REC.1396.295），所有参与者签署书面知情同意书。采用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）管采集全血并储存于-20°C，随后采用盐析法提取基因组DNA。
基因分型采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP）方法。每个0.20 mL PCR反应管包含1 μL基因组DNA（约100 ng/ml）、各1 μL引物（10 μM）、7 μL 2X预混液及适量双蒸水。扩增步骤包括95°C初始变性5分钟，随后30个循环（95°C 30秒，各变异对应退火温度30秒，72°C 30秒），最后72°C延伸5分钟。PCR产物经相应限制性内切酶消化后，通过2%琼脂糖凝胶电泳分离。约20%样本随机重复基因分型，结果显示100%一致性。所有等位基因命名基于人类参考基因组（GRCh38）正义链。
生物信息学分析方面，研究人员使用SpliceAid 2工具检测SNV对调控蛋白结合的影响；利用Cytoscape工具和StringApp插件对从miRWalk数据库获得的经验证的miRNA靶基因进行功能可视化与分析。
统计分析采用IBM SPSS v. 22软件。连续变量以均值±标准差描述，分类变量以数量和百分比描述。病例与对照组间数据比较分别采用独立样本t检验和卡方检验，当超过20%的期望细胞频率小于5或任一期望细胞频率低于1时采用Fisher精确检验。采用单因素逻辑回归分析计算粗比值比（odds ratio, OR）和95%置信区间（confidence interval, CI），评估各遗传变异在共显性、显性、隐性和等位基因遗传模式下与前列腺癌风险的关联。初步分析显示年龄不是显著混杂因素，故未纳入协变量。p<0.05视为具有统计学显著性，并采用Bonferroni校正计算调整后p值。
三、研究结果
3.1 变异与前列腺癌风险的关联
研究最终纳入194例前列腺癌患者和240例无癌对照者。病例平均年龄62.72±6.39岁，对照组平均年龄62.02±6.45岁，两组间无显著年龄差异（p=0.259）。
pre-miR-938（rs2505901）T>C变异在共显性（C/C vs. T/T）、显性（T/C+C/C vs. T/T）和等位基因（C vs. T）模式下均显示与前列腺癌风险降低相关，但这些关联均未达到统计学显著性。pre-miR-618（rs2682818）C>A变异在共显性（OR=2.679，95% CI：1.405-5.111，p=0.008，A/A vs. C/C）、隐性（OR=2.298，95% CI：1.258-4.198，p=0.024，A/A vs. C/C+C/A）和等位基因（OR=1.486，95% CI：1.124-1.963，p=0.020，A vs. C）模式下与前列腺癌风险显著增加相关，但显性模式未达显著性。HULC（rs7763881）A>C变异在显性（OR=0.574，95% CI：0.390-0.844，p=0.02，A/C+C/C vs. A/A）和等位基因（OR=0.632，95% CI：0.464-0.862，p=0.016，C vs. A）模式下与前列腺癌风险显著降低相关。HOXA11-AS（rs17427875）变异与前列腺癌风险之间未发现显著关联。
3.2 变异与前列腺癌临床病理特征的关联
pre-miR-618（rs2682818）和HULC（rs7763881）变异与诊断年龄显著相关（p=0.044和p=0.016）。其他研究变异与前列腺癌临床特征之间未发现显著关联。对照组中rs2505901、rs2682818、rs17427875和rs7763881的基因型分布均符合哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium, HWE）（p分别为0.090、0.091、0.492和0.808）。
3.3 生物信息学分析结果
SpliceAid 2工具分析显示：rs2682818变异在突变状态下获得SRp30c蛋白的预测结合位点，同时丢失野生型中存在的hnRNP H1、hnRNP H2、hnRNP F和hnRNP H3蛋白的所有预测结合位点。rs17427875变异在突变状态下获得SRp20蛋白的预测结合位点。rs2505901变异导致SC35蛋白预测结合位点丢失，同时获得hnRNP A1、SRp40、hnRNP F、ZRANB2和hnRNP H3蛋白的预测结合位点。rs7763881变异未引起蛋白结合位点的任何改变。
通过Cytoscape工具中StringApp对hsa-miR-938和hsa-miR-618靶基因进行功能富集分析显示，这些基因大多参与细胞过程的负调控、大分子代谢、氮化合物代谢、细胞生物合成以及序列特异性DNA结合和核受体信号传导。因此，rs2505901和rs2682818变异中的核苷酸改变可能对这些过程和功能产生潜在影响。
四、讨论与结论
本研究是首个在伊朗人群样本中评估这些特定miRNA和lncRNA变异与前列腺癌及其临床病理特征关联的研究。研究发现HULC rs7763881变异与较低的前列腺癌风险相关，pre-miR-618 rs2682818变异与增加的前列腺癌风险相关，而pre-miR-938 rs2505901和HOXA11-AS rs17427875变异未显示显著关联。此外，前列腺癌诊断年龄与pre-miR-618 rs2682818和HULC rs7763881相关，但pre-miR-938和HOXA11-AS变异与前列腺癌临床病理特征之间未检测到关联。
研究人员指出，miR-938在肿瘤发生中的作用被认为由TGF-β和PI3K介导，该通路可能参与前列腺癌细胞迁移。miR-618在前列腺癌中的作用存在争议：一项实验表明miR-618可能通过调节叉头盒蛋白p2（forkhead box protein p2, FOXP2）对前列腺癌侵袭发挥保护作用，而另一项研究则显示该miR可降低基质金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitors of matrix metalloproteinase, TIMP），可能诱导前列腺癌转移。HOXA11-AS已被证明可促进前列腺癌肿瘤细胞增殖，并可能通过葡萄糖代谢改变发挥作用，还可能在骨转移中起作用。HULC在前列腺癌相关细胞和组织中上调，并与前列腺癌患者的不良结局相关，HULC敲低与前列腺癌相关细胞对放射治疗的更有利反应相关。
研究存在以下局限性：样本量较小，未进行先验功效分析和样本量计算；对照组由BPH患者组成，BPH与前列腺癌可能存在的共同潜在机制可能成为偏倚来源；未评估复制队列；Gleason评分采用简单的二分法分类，未考虑Gleason评分7（即3+4与4+3）内部的预后异质性；逻辑回归模型未针对潜在混杂因素进行调整。
结论：本研究评估了伊朗人群中不同SNV与前列腺癌的关联。HULC变异与较低的前列腺癌风险相关；特定pre-miR-618变异与前列腺癌风险增加相关；pre-miR-938 rs2505901和HOXA11-AS rs17427875变异未显示显著关联。尽管前列腺癌诊断年龄与pre-miR-618 rs2682818和HULC rs7763881相关，但未检测到pre-miR-938和HOXA11-AS变异与前列腺癌临床病理特征之间的关联。生物信息学分析为所检测到的变异与前列腺癌风险关联中可能涉及的分子机制提供了假说。总体而言，本研究中提出的变异在充分外部验证后，可考虑纳入未来研究以开发基于人群的前列腺癌风险评估工具。更深入的分子研究可揭示所研究变异在前列腺癌发病机制中的潜在作用。
