抗生素诱导耐药乳酸杆菌对产碳青霉烯酶肠杆菌的抗菌活性及其益生特性评价

《Frontiers in Microbiology》：Antimicrobial activity of antibiotic-induced resistant lactobacilli against carbapenemase-producing Enterobacterales

　　

背景：产碳青霉烯酶肠杆菌（carbapenemase-producing Enterobacterales, CPE）是全球重大健康威胁，治疗选择极为有限。已有研究报道乳酸杆菌对CPE具有抗菌活性，但在抗生素耐药诱导后——鉴于定植或感染患者常同时接受抗生素暴露，这一条件具有临床相关性——该活性以及关键益生特性是否保留，此前尚未明确。方法：研究人员将野生型植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum, LYC1322）、副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei, LYC1154）和鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus, LYC1511），以及通过氨苄西林、米诺环素和红霉素连续亚致死浓度暴露诱导产生的抗生素耐药变异株（命名为“ame”），采用体外共培养试验检测其对17株临床CPE分离株（涵盖6个菌种、5种碳青霉烯酶类型，即KPC、NDM、OXA-181、IMP-8和VIM-1）的抗菌活性。同时，研究人员还对全部6株菌进行了胃肠道耐受性（胃蛋白酶和牛胆汁试验）及Caco-2上皮细胞黏附能力评价。结果：野生型与ame诱导乳酸杆菌变异株均显著降低CPE存活量，在24小时时使大多数分离株的可回收CPE降至检测限以下（<10 CFU/mL），48小时时使全部17株分离株降至检测限以下；相比之下，仅含CPE的对照组维持在10⁶–10⁹ CFU/mL。该活性在全部6株菌及所测5种碳青霉烯酶类型中表现一致。在模拟胃液（胃蛋白酶，pH 3.0）和肠道胆汁盐（0.3%牛胆汁）条件下，ame诱导变异株相较其野生型亲本株未出现明显的存活率下降，但菌株间胆汁耐受性差异显著；在两种接种密度下，野生型与ame诱导变异株对Caco-2单层细胞的黏附能力表现相似。结论：在本研究采用的体外条件下，抗生素耐药诱导与抗CPE活性、胃肠道应激耐受性或上皮黏附能力的明显下降无关，诱导变异株对所检测的全部CPE分离株均保持活性，不过胆汁耐受性存在菌株间差异。由于未进行可逆性检测和全基因组测序，诱导表型可能代表稳定获得性耐药而非适应性耐药，且这些变异株的安全性评估仍不完整。因此，上述发现属于初步性、假设生成性结果；在任何辅助性益生菌应用得以考虑之前，仍需开展机制、基因组、动物及临床研究，包括在合并抗生素治疗条件下的评估。

论文解读：抗生素诱导耐药乳酸杆菌抗产碳青霉烯酶肠杆菌的活性与益生特性

一、研究背景与拟解决的科学问题

产碳青霉烯酶肠杆菌（carbapenemase-producing Enterobacterales, CPE）已被世界卫生组织列为亟需优先关注的“关键优先级”病原体。CPE感染在重症、免疫低下及器官移植患者中具有较高的发病率和死亡率。此类细菌携带的碳青霉烯酶，包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC）、新德里金属-β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase, NDM）、OXA-48样碳青霉烯酶、亚胺培南酶（imipenemase, IMP）以及维罗纳整合子编码的金属-β-内酰胺酶（Verona integron-encoded metallo-β-lactamase, VIM），显著压缩了临床可用抗生素的空间。尽管头孢他啶-阿维巴坦等新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复方对部分产KPC和OXA-48菌株有效，但对产金属-β-内酰胺酶的菌株活性有限。在此背景下，探索辅助性抗感染策略具有重要意义。

乳酸杆菌作为人体肠道微生态的重要成员，可通过产生有机酸、细菌素、过氧化氢以及对上皮黏附位点的竞争性排斥等机制抑制肠道病原体。已有研究显示野生型乳酸杆菌对耐碳青霉烯肠杆菌（carbapenem-resistant Enterobacterales, CRE）具有抑制活性。然而，一个具有直接临床相关性的问题尚未解决：在CPE定植或感染患者经常接受抗生素治疗的现实中，传统益生菌会被抗生素抑制，难以发挥拮抗作用。乳酸杆菌在亚致死抗生素暴露后可产生抗生素诱导耐药，但这种诱导耐药是否会影响其抗CPE活性及关键益生特性，此前未见系统报道。因此，研究人员设计了本项体外研究，系统地评估野生型与抗生素诱导耐药乳酸杆菌对多种临床CPE分离株的抗菌活性，并考察诱导耐药对胃肠道耐受性和上皮黏附等益生特性的影响。

二、研究内容与主要结论

研究人员选取了三种乳酸杆菌：副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei LYC1154）、植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum LYC1322）和鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus LYC1511）。通过连续亚致死浓度暴露于氨苄西林、米诺环素和红霉素，诱导产生耐药变异株，命名为“ame”变异株（LYC1154ame、LYC1322ame、LYC1511ame）。研究共纳入17株临床CPE分离株，涵盖大肠埃希菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、克氏柠檬酸杆菌（Citrobacter koseri）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）和黏质沙雷菌（Serratia marcescens），涉及KPC-2、NDM、OXA-181、IMP-8和VIM-1五种碳青霉烯酶类型，样本来源于痰液、直肠拭子、血液和尿液等临床标本。

研究结果表明，所有六株乳酸杆菌（三株野生型及三株ame诱导变异株）在共培养24小时时即对大多数CPE分离株产生超过4个log₁₀的菌量下降，48小时时将全部17株CPE分离株降至检测限以下（<10 CFU/mL），而仅含CPE的对照组在整个实验期间维持在10⁶–10⁹ CFU/mL。这一抗CPE活性在六株乳酸杆菌和五种碳青霉烯酶类型中表现一致。在益生特性方面，胃蛋白酶（pH 3.0）模拟胃液条件下，ame变异株在4小时内的存活率相对起始接种量下降不超过1.5个log₁₀，与野生型相当；在0.3%牛胆汁条件下，胆汁耐受性在菌株间差异显著，野生型中LYC1511耐受性最强（107%），LYC1322最弱（5%），ame变异株分布在39%–68%的范围内，但总体而言未观察到诱导耐药导致胃肠道耐受性的明显下降。Caco-2上皮细胞黏附试验显示，在10⁸和10⁹ CFU/mL两种接种密度下，ame变异株与野生型的黏附能力无明显差异。

研究人员据此得出结论：抗生素诱导耐药与抗CPE活性、胃肠道应激耐受性或上皮黏附能力的明显降低无关，诱导变异株对所检测的全部CPE分离株均保持活性。但研究人员同时审慎指出，因未进行可逆性检测和全基因组测序，诱导表型可能代表稳定获得性耐药而非适应性耐药，安全评估尚不完整，相关发现属于初步性、假设生成性结果。

三、关键技术与方法

本研究主要采用了以下关键技术方法。样本来源方面，CPE临床分离株共17株，涵盖六个肠杆菌菌种，分离自痰液、直肠拭子、血液和尿液等临床标本，均经VITEK 2系统生化鉴定和聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）测序确认碳青霉烯酶基因。抗生素耐药诱导采用连续亚致死浓度（0.5 × 最低抑菌浓度，minimum inhibitory concentration, MIC）逐步递增法，依次以氨苄西林、米诺环素和红霉素进行诱导，每株菌最多诱导四周，并设置平行传代的野生型对照。MIC测定采用肉汤微量稀释法，参照CLSI M45（第3版）对少见或苛养菌的检测指南，共涉及30种抗菌药物、11个药物类别。抗CPE活性评价采用体外共培养试验，乳酸杆菌与CPE比例为10:1，在MRS-MH（1:1）培养基中有氧共培养，24小时和48小时取樣并采用麦康凯琼脂选择性计数残余CPE。胃肠道耐受性评价采用胃蛋白酶（3 mg/mL，pH 3.0）耐性试验和0.3%牛胆汁耐性试验，以log₁₀变化或与无胆汁对照的百分比表示存活率。上皮黏附能力采用人结直肠腺癌细胞系Caco-2（ATCC HTB-37）单层黏附试验，黏附后以Triton X-100裂解细胞并计数CFU。所有试验均设两个独立生物学重复（n=2），数据以描述性统计呈现。

四、研究结果分述

（一）野生型与抗生素诱导耐药乳酸杆菌的抗生素敏感性谱

MIC结果显示，ame诱导变异株相对野生型产生了大幅升高的MIC。氨苄西林MIC在所有三株ame变异株中升高8至16倍；红霉素MIC在LYC1154ame和LYC1511ame中从≤0.125 μg/mL升高到>128 μg/mL，在LYC1322ame中升高到8 μg/mL。碳青霉烯类抗生素的MIC也出现不同程度升高，其中美罗培南MIC在LYC1322ame中升高至少32倍（从≤0.125到4 μg/mL）。阿奇霉素、克林霉素和部分β-内酰胺类药物的MIC均显著上升，而氨曲南、多黏菌素、万古霉素、替考拉宁和夫西地酸的MIC在诱导后基本保持不变或仅轻微升高。

（二）胃肠道耐受性

在胃蛋白酶（pH 3.0）条件下，全部六株乳酸杆菌在4小时内的存活率相对起始接种量下降均小于1.5个log₁₀，ame变异株与各自野生型相应时间点的存活情况相似。在0.3%牛胆汁条件下，菌株间胆汁耐受性差异较为明显。24小时时，野生型菌株存活百分比介于5%至107%之间，其中LYC1511耐受性最强（107%）、LYC1322最弱（5%）；ame变异株介于39%至68%之间。诱导后变化方向因菌株而异：LYC1322ame较亲本株升高（46%对5%），LYC1511ame较亲本株下降（68%对107%），LYC1154ame与亲本株接近（39%对52%）。总体而言，在检测条件下未观察到诱导耐药导致的胃和胆汁耐受性明显降低。

（三）可回收产碳青霉烯酶肠杆菌的降低

在24小时共培养后，野生型乳酸杆菌对大多数产碳青霉烯酶大肠埃希菌分离株产生超过4个log₁₀的降低，部分分离株已低于检测限（<10 CFU/mL）。ame变异株在24小时时对可回收大肠埃希菌产生2–3至>4个log₁₀的降低，依菌株和分离株而异。在48小时时，所有六株乳酸杆菌（野生型及ame）均将全部大肠埃希菌分离株降至检测限以下。针对5株肺炎克雷伯菌（KPC-2、OXA-181、NDM-1、VIM-1、IMP-8），大多数共培养在24小时即降至检测限以下，48小时时所有六株菌均将全部分离株降至检测限以下。针对两株弗氏柠檬酸杆菌（IMP-8、VIM-1）、1株克氏柠檬酸杆菌（OXA-181）、3株阴沟肠杆菌（IMP-8、NDM-1、VIM-1）和1株黏质沙雷菌（IMP-8），所有六株乳酸杆菌在24小时和48小时均将可回收计数降至检测限以下，而相应CPE-only对照组始终维持在10⁷–10⁹ CFU/mL。

（四）Caco-2细胞黏附

在所测试的两种接种浓度（10⁸和10⁹ CFU/mL，对应感染复数分别为1,000:1和100:1）下，野生型和ame诱导变异株均能黏附至Caco-2单层细胞，且ame变异株的黏附能力与相应野生型菌株相似，未观察到明显下降。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究的核心发现在于抗生素诱导耐药并未削弱乳酸杆菌的抗CPE活性，且诱导变异株的胃蛋白酶耐受性、胆汁盐耐受性和Caco-2上皮黏附能力与野生型总体上保持一致，但胆汁耐受性在菌株间差异明显，体现为菌株特异性特征。研究人员强调，这是首个专门针对抗生素诱导耐药乳酸杆菌抗CPE活性及益生特性进行表征的研究。在机制层面，此前的体外研究已确定乳酸杆菌的抗CRE活性主要来源于乳酸，但本研究未对ame变异株效应分子进行鉴定，不能推断诱导后仍由酸介导机制发挥作用。研究人员还指出，诱导耐药应区别于耐受或持留，且因缺乏全基因组测序和可逆性检测，无法区分适应性耐药与稳定获得性耐药。安全性评估方面，诱导耐药表型的可转移性尚未排除，转移性耐药决定簇的排除是进一步临床开发的首要前提。研究人员最后总结，CPE定植患者常接受抗生素治疗，能在抗生素环境中存活的诱导耐药乳酸杆菌，理论上可作为减少肠道CPE定植的辅助手段，但本研究仅提供初步体外证据，仍需机制学、基因组学、动物模型和临床研究验证，包括在合并抗生素治疗条件下的评估。研究结论部分可归纳为：本研究证明抗生素诱导耐药乳酸杆菌变异株在抗CPE活性和所检测的益生特性方面未见明显下降，这些菌株对多种携带主要碳青霉烯酶类型的肠杆菌菌种保持活性，胃肠道应激耐受性和上皮黏附性总体与亲本菌株一致，但胆汁耐受性为菌株依赖性特征。上述发现提供了初步的体外证据，但在缺乏动物和临床验证的情况下仅为体外观察结果；由于耐药表型的遗传基础和可转移性尚未确定，在正式排除可转移性耐药决定簇之前，不应考虑将抗生素耐药菌株有意给予患者。