《Frontiers in Veterinary Science》：Development, characterization, and immunomodulatory evaluation of a liposomal DNA vaccine targeting Schistosoma mansoni IPSE/α-1
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背景/目的：曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）在流行地区仍然是一个重大公共卫生问题，亟需创新的疫苗策略。本研究旨在开发一种靶向免疫调节抗原——曼氏血吸虫卵白细胞介素-4诱导原理α-1（IPSE/alpha-1）的DNA疫苗，该抗原是曼氏血吸虫
背景/目的：曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）在流行地区仍然是一个重大公共卫生问题，亟需创新的疫苗策略。本研究旨在开发一种靶向免疫调节抗原——曼氏血吸虫卵白细胞介素-4诱导原理α-1（IPSE/alpha-1）的DNA疫苗，该抗原是曼氏血吸虫卵分泌的一种主要糖蛋白，已知可诱导IL-4产生并促进Th2型免疫应答。
方法：研究人员将IPSE/alpha-1基因进行哺乳动物表达密码子优化，克隆至pVAX-1载体，转化DH5α菌株，经菌落PCR确认后进行质粒提取。采用薄膜水化法结合手动挤出工艺，以DC-Chol与DOPE脂质按1:1摩尔比配制脂质体纳米颗粒，并与DNA疫苗复合。制备了不同氮磷比（N/P ratio）（1:1至6:1）的制剂，并通过粒径和Zeta电位进行表征。使用人包皮成纤维细胞-1（HFF-1）通过MTS法评估细胞毒性。体内实验选用100只雄性白化小鼠，分为四组，分别给予磷酸盐缓冲液（PBS）或1、2、3 μg/mL的疫苗制剂，以评估促炎和抗炎细胞因子的调节情况。
结果：N/P比为3:1的制剂获得了平均直径小于200 nm、Zeta电位约为+30 mV的纳米颗粒。MTS检测显示，浓度≤1 μg/mL时细胞存活率较高，而更高浓度则表现出剂量依赖性细胞毒性。半数抑制浓度（IC50）估计在2–4 μg/mL之间。体内实验显示出剂量和时间依赖性的免疫调节作用。在干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-10（IL-10）中，2 μg/mL剂量始终产生最强且最持久的反应。IFN-γ表现为延迟但强烈的激活，IL-4从48小时开始稳步上升，IL-10则呈现早期升高随后在后期受到调控性增加的模式。
结论：研究结果证实成功构建并表征了一种靶向IPSE/alpha-1的脂质体复合DNA疫苗，其具有良好的理化性质和较低浓度下的低细胞毒性。体内细胞因子分析显示了剂量和时间依赖性的免疫应答调节，凸显了所开发制剂的免疫调节潜力。这些发现为未来针对曼氏血吸虫感染的免疫原性和保护效力研究提供了支持。
研究背景与目的
血吸虫病（schistosomiasis，又称bilharzia）是一种由裂体吸虫属（Schistosoma）吸虫引起的急慢性寄生虫病，在热带和亚热带地区仍是重大公共卫生问题。据2021年全球疾病负担估算，血吸虫病影响全球约1.514亿人，导致近175万伤残调整寿命年（DALYs）和12858例死亡。世界卫生组织更近期的数据显示，2024年有2.537亿人需要预防性治疗，每年约有14353例死亡归因于血吸虫病。曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）是肠道血吸虫病的主要病原体，可导致慢性腹部、肝脏和肠道病变。目前控制策略主要依赖大规模施用吡喹酮（praziquantel），但该方法不能防止再感染，且耐药性问题日益凸显，因此亟需开发有效疫苗。DNA疫苗因其能同时诱导体液和细胞免疫应答、稳定性好且易于生产而成为有前景的研究方向。本研究选择曼氏血吸虫卵分泌的主要免疫活性糖蛋白——白细胞介素-4诱导原理α-1（IPSE/alpha-1）作为靶抗原，该抗原已知能诱导嗜碱性粒细胞释放白细胞介素-4（IL-4）并促进Th2型免疫应答。尽管已有多种候选疫苗被研究，但针对IPSE/alpha-1的脂质体复合DNA疫苗的探索仍有限。本研究旨在构建编码密码子优化的IPSE/alpha-1基因的DNA疫苗候选物，将其克隆至pVAX-1表达载体，并与脂质体纳米颗粒复合，表征制剂的理化性质，评估其体外细胞毒性及体内对细胞因子应答的影响，为后续抗原特异性免疫原性和保护效力的研究提供基础数据。
主要关键技术方法
研究人员首先对曼氏血吸虫IPSE/alpha-1基因进行哺乳动物表达密码子优化，合成后通过HindIII和KpnI限制性酶切位点定向克隆至pVAX-1载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经卡那霉素筛选和菌落聚合酶链式反应（colony PCR）验证阳性克隆后大量提取质粒。随后采用薄膜水化法结合手动挤出技术，以阳离子脂质DC-Chol与辅助脂质DOPE按1:1摩尔比制备脂质体纳米颗粒，并与质粒DNA在不同氮磷比（N/P ratio）下复合。使用动态光散射（DLS）和Zeta电位分析仪表征粒径和表面电荷，通过琼脂糖凝胶阻滞实验定性评估DNA复合效率。体外细胞毒性采用MTS法在人包皮成纤维细胞-1（HFF-1）上进行评估。体内实验使用100只来自沙特国王大学中央实验室的健康雄性瑞士白化小鼠，随机分为四组，分别接受磷酸盐缓冲液（PBS）或1、2、3 μg/mL的疫苗制剂，并在接种后24小时、48小时、7天、14天和21天五个时间点采集血液，使用基于Luminex的多重检测技术测定血清中干扰素-γ（IFN-γ）、IL-4和白细胞介素-10（IL-10）的水平。
研究结果
3.1 IPSE/alpha-1基因的优化与合成：研究人员选择了曼氏血吸虫的IPSE/alpha-1序列作为靶抗原，并对其进行了密码子优化，加入了侧翼的HindIII和KpnI限制性酶切位点，以确保在哺乳动物系统中的高效表达。
3.2 pVAX1-IPSE/α-1的克隆、转化与纯化：合成的IPSE/alpha-1基因经双酶切后成功连接到同样酶切的pVAX-1质粒中，转化DH5α细胞后，通过菌落PCR扩增出预期产物，证实了插入片段的成功克隆。纯化的质粒经NanoDrop定量，获得高浓度DNA。
3.3 脂质体复合DNA疫苗的制备与理化表征：通过薄膜水化法和手动挤出制备了脂质体复合DNA疫苗。动态光散射分析显示，优化的3:1 N/P比制剂具有均一的纳米颗粒群体，平均粒径低于200 nm，Zeta电位约为+30 mV，表明阳离子脂质与质粒DNA之间存在成功的静电相互作用。
3.4 凝胶阻滞实验：琼脂糖凝胶阻滞实验显示，随着N/P比从1:1增加到6:1，质粒DNA的迁移逐渐减少直至完全阻滞。N/P比为3:1及以上时未观察到游离DNA迁移，因此3:1被确定为最佳N/P比。密度分析显示，1:1比例时约91.9%的DNA被复合/阻滞，而2:1及以上比例则达到完全或接近完全的复合。
3.5 MTS法评估DNA负载纳米颗粒的细胞毒性：在HFF-1细胞上的MTS检测结果显示，浓度≤1 μg/mL时细胞活力保持高水平（如0.125 μg/mL时活力达109.82%），而在2 μg/mL及以上浓度时出现剂量依赖性下降，2、4、8和16 μg/mL时的活力分别为66.20%、35.06%、19.79%和13.92%。半数抑制浓度（IC50）估计在2-4 μg/mL之间。
3.6 小鼠抗血吸虫疫苗接种后剂量依赖性IFN-γ应答评估：IFN-γ水平呈剂量和时间依赖性变化。早期（24-48小时）所有处理组的IFN-γ水平均低于对照组。在第7天，1和3 μg/mL组仍较低，而2 μg/mL组出现部分恢复。到第14天，尤其是1和2 μg/mL组的IFN-γ水平显著升高，此升高持续至第21天，其中2 μg/mL组在所有测试组中表现出最高的IFN-γ水平。这表明中间剂量（2 μg/mL）可能最优地刺激了Th1极化。
3.7 小鼠抗血吸虫疫苗接种后剂量依赖性IL-4应答评估：IL-4表现出时间和剂量依赖性调节。接种后24小时各组间无显著差异，但在48小时，特别是2 μg/mL组的IL-4水平显著升高，并在第7、14和21天持续维持在高水平。3 μg/mL剂量并未进一步增强IL-4的产生，提示可能存在剂量阈值效应或调节反馈机制。
3.8 小鼠抗血吸虫疫苗接种后剂量依赖性IL-10调节：IL-10呈现出清晰的剂量和时间依赖性模式。高剂量（3 μg/mL）和中等剂量（2 μg/mL）组在接种后24小时内即出现急剧升高，显示早期调节性免疫应答的启动。到第7天，所有组的IL-10水平下降。在第14天，2 μg/mL组的IL-10再次升高并达到峰值，而3 μg/mL组则显著下降。到第21天，2 μg/mL组的IL-10仍维持在较高水平。总体而言，疫苗诱导了动态的、剂量响应性的IL-10调节。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究成功构建、制备并初步评估了靶向曼氏血吸虫IPSE/alpha-1抗原的脂质体复合DNA疫苗。通过对IPSE/alpha-1进行密码子优化并定向克隆至pVAX-1载体，为哺乳动物表达提供了质粒平台，但转基因表达在本研究中未得到实验证实。将DNA与DC-Chol和DOPE脂质复合制备的纳米颗粒粒径小于200 nm、Zeta电位约+30 mV，这些特性有利于细胞摄取和内体逃逸。细胞毒性结果表明，浓度≤1 μg/mL时制剂安全性良好，而更高浓度则出现剂量依赖性细胞毒性。体内细胞因子分析揭示了动态的、剂量和时间依赖性的免疫调节模式：IFN-γ在中期（第14天）出现强烈激活，提示适应性细胞免疫的建立；IL-4从48小时起持续升高，尤其在2 μg/mL剂量组最为显著；IL-10则在早期（24-48小时）即出现高水平，随后在后期（第14-21天）再次升高，体现了免疫调节机制的参与。研究人员强调，这些细胞因子谱反映了全身性的免疫调节，但不能直接证明IPSE/alpha-1特异性的免疫原性。本研究的局限性包括：最终构建的pVAX1-IPSE/α-1质粒未经Sanger测序独立验证，其在哺乳动物细胞中的表达也未通过实验确认；免疫学评估仅限于血清细胞因子测量，未能确立抗原特异性免疫应答。
研究结论部分翻译如下：本研究开发并理化表征了一种靶向曼氏血吸虫免疫调节抗原IPSE/alpha-1的脂质体复合DNA疫苗候选物。通过密码子优化和克隆至pVAX-1载体，随后与基于DC-Chol/DOPE的脂质体复合，该DNA疫苗候选物展现出有利的理化性质，包括纳米级粒径和正Zeta电位。重要的是，该制剂在凝胶阻滞实验中表现出定性的质粒DNA复合能力，且在较低浓度下具有最小细胞毒性。观察到的细胞因子谱提示该制剂可能调节全身性免疫应答，但尚不能确凿证明IPSE/alpha-1特异性的免疫原性。需要进一步评估抗原特异性体液和细胞免疫应答以及保护效力的研究，以确认该疫苗候选物用于血吸虫病防控的潜力。
