《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Adeno-associated virus gene delivery targeting corneal-projecting trigeminal ganglion neurons
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角膜神经支配对于眼表稳态和保护至关重要，然而选择性标记和操纵角膜投射神经元的方法仍然有限。传统的逆行示踪剂可以识别三叉神经节（TG）中的角膜投射胞体，但它们无法实现基因编码效应蛋白、传感器或重组酶的表达。本研究描述并验证了角膜基质内腺相关病毒（AAV）递送作为
角膜神经支配对于眼表稳态和保护至关重要，然而选择性标记和操纵角膜投射神经元的方法仍然有限。传统的逆行示踪剂可以识别三叉神经节（TG）中的角膜投射胞体，但它们无法实现基因编码效应蛋白、传感器或重组酶的表达。本研究描述并验证了角膜基质内腺相关病毒（AAV）递送作为标记小鼠角膜投射TG神经元的一种方法。将1–2 μL病毒注射入角膜基质，并在注射后2–12周于透明化全TG、TG切片、角膜整体铺片及厚脑干切片中评估标记效果。多种AAV载体，包括表达tdTomato、eGFP或mCherry的载体以及在Ai14 tdTomato报告小鼠中表达Cre的载体，均产生了一致的神经元标记，主要集中在TG的眼支（V1）背内侧区域。天然tdTomato荧光易于检测，而eGFP标记可通过使用荧光增强抗体的免疫标记得到增强，从而提高了对标记胞体和轴突纤维的检出率。AAV介导的TG标记与从角膜进行的麦胚凝集素（WGA）和快蓝（Fast Blue）示踪结果高度重叠，尽管AAV标记的神经元总数较少。表达Cre的AAV载体在Ai14小鼠中激活了报告基因表达，证明了其与转基因报告策略的兼容性。标记的轴突在外周和中枢投射位点均可观察到。在眼表，报告基因表达与神经元转导程度相关。在中枢投射方面，标记可见于三叉神经脑干复合体的主核（subnucleus principalis）、极间核/尾侧核过渡区（interpolaris/caudalis transition zone），以及延伸至上颈髓的尾侧亚核（caudal subnucleus caudalis）。AAV转导未引起明显的免疫激活。这些结果表明，角膜基质内AAV递送为解剖学示踪和遗传学获取角膜投射神经元提供了一种多功能方法，能够实现光遗传学和化学遗传学控制、活性监测及靶向遗传操作所需基因编码工具的表达。
研究背景与科学问题
角膜神经支配对于维持眼表稳态、保护及损伤后修复至关重要。角膜传入神经协调保护性反射和行为，如泪液分泌和眨眼，以响应机械、热、化学和渗透刺激。由于绝大多数角膜神经元是伤害感受性的，它们高度敏感地检测潜在疼痛或威胁信号。这些神经还与上皮和基质微环境密切相互作用，调节上皮维持、炎症和伤口愈合。因此，角膜感觉信号改变可导致神经病理性角膜疼痛、干眼症和神经营养性角膜病变等眼表疾病。传统逆行示踪剂（如WGA、HRP-WGA、Fluoro-Gold、Fast Blue和霍乱毒素B）虽能识别TG中的角膜投射神经元胞体，但无法提供遗传学通路，不能表达基因编码的报告基因、重组酶、传感器或效应蛋白。重组AAV作为一种潜在的策略，可以通过轴突摄取和运输将转基因递送至目标细胞群，但此前角膜内AAV递送主要用于基质细胞和角膜细胞的转导，尚未系统评估其用于标记和遗传学操纵角膜投射TG神经元的可行性。因此，本研究的目的是系统评价角膜基质内AAV递送作为获取角膜投射TG神经元遗传学通路的策略。
研究设计与主要结论
研究人员系统评价了一系列不同血清型、启动子和报告基因的AAV载体，通过角膜基质内注射的方式，在小鼠模型中评估其对角膜投射TG神经元的标记效率。研究得出以下主要结论：角膜基质内AAV递送能够在多个独立实验室中重复、稳定地标记角膜投射TG神经元，标记主要集中在TG眼支（V1）的背内侧区域；AAV2-retro-CAG组合显示出最高的标记效率，接近传统逆行示踪剂的水平；AAV介导的标记与传统示踪剂WGA和Fast Blue有高度重叠，但标记神经元数量略少；eGFP标记可通过抗体扩增显著提高检测灵敏度；AAV载体可实现Cre依赖的转基因重组策略；标记的轴突在外周角膜和中枢脑干投射位点均可观察到，中枢投射模式与传统示踪结果一致。
关键技术与方法
主要关键技术包括：（1）角膜基质内显微注射技术，使用玻璃Hamilton注射器配合33号斜面针头或35号斜面针头，将1–2 μL AAV病毒悬液注入小鼠角膜基质层；（2）组织透明化处理（SHIELD方法）结合光片荧光显微镜成像，用于全TG三维成像和神经元计数；（3）免疫荧光标记增强技术，特别是使用抗GFP抗体放大eGFP信号；（4）基于Imaris软件的机器学习自动化细胞检测和定量分析流程；（5）自主研发的ImageJ插件（corneal_nerves）用于自动化分析角膜神经纤维密度。动物来源包括C57BL/6J、Ai14 tdTomato报告小鼠、Scn10aCre及Rosa26-DTA176等转基因品系。
研究结果
全组织光片成像显示角膜投射神经元分布：通过角膜基质内注射表达荧光报告基因（tdTomato、eGFP）或Cre重组酶的AAV载体，经组织透明化和光片显微镜成像，在所有测试的AAV血清型中均观察到一致的神经元标记，主要集中在TG眼支（V1）背内侧区域。tdTomato可直接检测，而eGFP需经抗体扩增以提高信号强度。
定量比较不同AAV标记的神经元总数：对AAV2-retro-CAG-tdTomato、AAV2-retro-CAG-Cre、AAV2-retro-hSyn-Cre和AAV6-CMV-eGFP四种载体的定量比较显示，各组间无统计学差异。但AAV2-retro-CAG-tdTomato标记数量最高（182.3±14.14），AAV6-CMV-eGFP最低（74.25±25.15）。在两个独立实验室的平行比较中，AAV2-retro-CAG-tdTomato标记的神经元数量约为AAV6-CMV-eGFP的两倍。在缺失Nav1.8表达神经元的基因敲除小鼠中，未检测到AAV标记的神经元。
AAV标记与传统示踪的一致性确认：将AAV2-retro-CAG-tdTomato标记与WGA示踪进行对比，发现两者标记的神经元均位于相同的V1背内侧区域，约半数以上神经元被双重标记。AAV标记的神经元数量比WGA少约20%。与Fast Blue示踪的比较也获得了相似的重叠结果。约三分之一的tdTomato阳性神经元共表达降钙素基因相关肽（CGRP）。AAV标记的神经元胞体直径主要在10–25 μm范围内，符合C纤维和Aδ纤维的大小特征。
角膜神经支配与AAV标记效率的相关性：通过开发的ImageJ插件自动分析角膜神经纤维密度，发现角膜基底下神经丛（sub-basal plexus）中报告基因表达的密度与TG中被标记的神经元数量呈显著正相关（R2=0.72，p=0.03）。AAV2-retro产生的角膜tdTomato标记神经密度显著高于AAV9和AAV-PHP.S。
中枢投射模式的鉴定：AAV标记的中枢投射进入脑干后主要在同侧三叉神经脑干核复合体和前段颈髓终止。标记纤维在三个主要区域形成终末野：主核（Pr5）背侧区域、极间核/尾侧核过渡区（Vi/Vc transition zone，位于-7.4 mm bregma附近，跨度约0.3 mm），以及尾侧亚核（Vc）延伸至C1–C2脊髓背角浅层（I-II层）。在2/16的动物中还观察到稀疏投射至臂旁外侧核外侧面（LPBE）或K?lliker-Fuse核。
讨论与结论总结
本研究系统筛选并验证了一系列AAV血清型、启动子和报告基因用于标记角膜投射TG神经元的效率和特性。低效病毒适用于精细解剖示踪和高保真三维重建，高效病毒适用于群体复杂性分析和多组学研究。所有病毒血清型均选择性地转导TG眼支背内侧区域的神经元，标记的神经元群体代表了天然的角膜神经支配组成，主要为C纤维和少量Aδ神经元。AAV2-retro-CAG表现出最高的标记效率，接近传统逆行示踪剂的水平。启动子选择是关键实验设计因素：hSyn启动子可将表达限制在神经元，而CAG和CMV为广谱启动子。荧光团选择需考虑光谱特异性和光稳定性：tdTomato耐光漂但光谱宽，eGFP和mCherry支持抗体增强检测。AAV介导的标记可持续至少3个月，远长于传统示踪剂。中枢投射模式与既往传统示踪、c-Fos和电生理记录结果高度一致。综上所述，本研究建立并验证了一个可靠的AAV工具箱，可用于角膜投射TG神经元的解剖学示踪、功能研究和靶向基因治疗，并在两个独立实验室中验证了其可重复性和严谨性。
