《Frontiers in Molecular Neuroscience》：ANOS1 variant and PROK2 upregulation in familial Kallmann syndrome: integrative genetic, transcriptomic, and phenotypic study
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卡尔曼综合征（Kallmann syndrome, KS）源于嗅觉-促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）神经元系统的发育障碍，然而单个基因缺陷的分子后果仍未得到充分阐明。特别是，原发性遗传
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卡尔曼综合征（Kallmann syndrome, KS）源于嗅觉-促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）神经元系统的发育障碍，然而单个基因缺陷的分子后果仍未得到充分阐明。特别是，原发性遗传变异与影响神经发育通路的下游转录变化之间的联系仍知之甚少。在本研究中，研究人员分析了一个X连锁KS的波兰家系。研究人员在两个表现为低促性腺激素性性腺功能减退（hypogonadotropic hypogonadism）和嗅觉障碍的患病兄弟中鉴定出一个半合子ANOS1变异（c.452G>C；p.Cys151Ser）。该ANOS1变异仍被归类为意义不确定的变异（variant of uncertain significance, VUS）；然而，其与KS表型的共分离以及WAP结构域内一个高度保守半胱氨酸残基的替换支持其潜在的功能相关性及进一步研究的必要性。小基因（minigene）检测未显示该变异对ANOS1前体mRNA剪接产生可检测的影响，而直接转录本分析因外周血中ANOS1表达极低而受限。全血RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）显示患病个体中PROK2显著上调，实时定量反转录PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）证实两名患者均呈现一致的上调。在PROK2中未鉴定出编码区或剪接位点变异，也未检测到可检测的外显子使用改变。鉴于ANOS1和PROK2在嗅觉系统发育和GnRH神经元迁移中的互补作用，以及既往关于anosmin-1与PK2/PROKR2信号通路相关联的证据，这些发现提示ANOS1相关功能障碍可能伴随功能相关分子通路的继发性改变，尽管这一解释需要在适当的实验模型中加以验证。
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一、研究背景与目的
卡尔曼综合征（Kallmann syndrome, KS）是一种遗传异质性神经内分泌系统疾病，以低促性腺激素性性腺功能减退（hypogonadotropic hypogonadism）和嗅觉功能障碍为主要临床特征，表现为青春期延迟或缺失、不育，以及嗅觉缺失或严重嗅觉减退。这些症状反映了两个在嗅觉基板中具有共同胚胎起源的神经元群体——嗅觉感觉神经元（olfactory sensory neurons, OSNs）和促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）神经元——的发育缺陷，后者向丘脑下部的迁移在KS中受到干扰。KS在男性中患病率约为1:8000，女性约为1:40000。
尽管已有超过30个基因被鉴定与KS相关，但ANOS1是历史上第一个被鉴定与X连锁形式KS相关的基因，也是最受研究的基因，涉及约15%的KS病例。ANOS1编码anosmin-1，一种参与神经发生、细胞黏附、轴突导向、轴突侧支形成和神经元迁移的大分子糖蛋白，并参与嗅球的血管生成。然而，anosmin-1在GnRH神经元发育中的直接作用仍未完全阐明。此外，KS相关基因常表现出可变外显率和表型异质性，支持多基因（oligogenic）模型，即多个基因和通路汇聚产生疾病表型。
PROK2编码前动力蛋白2（prokineticin 2），是一种对嗅球发育和GnRH神经元迁移至关重要的信号分子，其破坏与KS表型相关。ANOS1和PROK2已被认为在嗅觉-GnRH轴的神经发育调控中发挥互补作用，提示两者可能在调控神经发育的分子信号网络中汇聚。然而，原发性遗传变异与下游转录变化之间的联系仍知之甚少。本研究旨在通过整合遗传学、转录组学和表型数据，探索ANOS1变异与PROK2转录失调之间的潜在关系。
二、研究内容与主要结论
研究人员分析了一个三代波兰家系，包括一名40岁母亲及其两名患病儿子（9岁和15岁）。两名兄弟均表现为出生后诊断的性腺功能减退，以小阴茎和隐睾为特征，并共享多种面部畸形特征。内分泌评估显示睾酮、黄体生成素（luteinizing hormone, LH）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH）水平降低，GnRH刺激后LH和FSH峰值反应迟钝，支持低促性腺激素性性腺功能减退的诊断。两名兄弟均报告嗅觉缺失。结合临床、激素和表型发现，诊断为KS。家系史提示X连锁隐性遗传。
研究人员在两名患病兄弟中鉴定出ANOS1基因的一个新型半合子错义变异（c.452G>C；p.Cys151Ser），其母亲和外祖母为杂合子携带者，父亲非携带者。该变异位于ANOS1外显子4，对应anosmin-1蛋白的WAP（whey acidic protein，乳清酸性蛋白）样结构域。该结构域以八个半胱氨酸残基（Cys134、Cys147、Cys151、Cys157、Cys163、Cys164、Cys168和Cys172）形成的保守四二硫键核心基序为特征，对正确折叠和结构完整性至关重要。跨物种序列比对显示这些半胱氨酸残基高度保守。该变异在gnomAD、dbSNP和ClinVar等公共数据库中未见报道。SIFT和PolyPhen-2等计算机预测工具提示该变异可能对蛋白质功能产生有害影响，但综合变异解读平台（VarSome和Franklin）基于现有ACMG/AMP证据将其归类为意义不确定的变异（variant of uncertain significance, VUS）。
小基因（minigene）剪接检测显示，该变异未引起ANOS1前体mRNA剪接的可检测改变。全血RNA测序（RNA-seq）未发现广泛的基因水平改变，但PROK2在患病个体中显著上调（FPKM：患病者66.4 vs. 对照34.28；FDR校正p值=0.00853），约为1.94倍增加。实时定量反转录PCR（qRT-PCR）验证了PROK2在两名患者中的一致上调（患者1约1.65倍，患者2约2.98倍）。Sanger测序排除了PROK2中的编码区或剪接位点变异，外显子水平分析也未检测到PROK2的显著外显子使用改变。此外，外显子水平分析在DUSP6（外显子3）和TCF25中检测到差异外显子使用，但qRT-PCR未在基因表达水平上证实DUSP6的改变。STRING数据库相互作用网络分析显示，ANOS1和PROK2之间无直接相互作用，但两者均位于一个涉及嗅觉发育和GnRH神经元迁移关键调控因子（包括CHD7、FGFR1、FGF8和PROKR2）的共享网络中。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了多种关键技术方法：对家系成员进行Sanger测序以鉴定ANOS1和PROK2基因的变异；进行小基因剪接检测以评估变异对前体mRNA剪接的影响；对两名患病兄弟、一名杂合子女性携带者和两名未患病对照的外周血样本进行全血RNA测序（RNA-seq），在Illumina NovaSeq X Plus平台生成约每样本1亿个双端读段；使用实时定量反转录PCR（qRT-PCR）验证基因表达变化；使用半定量RT-PCR评估转录本模式和剪接差异；使用DEXSeq进行外显子水平差异表达和可变剪接分析；使用SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster和REVEL等计算机工具进行变异功能预测；使用STRING数据库进行基因相互作用和通路分析。RNA-seq数据已存入Gene Expression Omnibus（GEO）数据库，登录号为GSE318901。
四、研究结果
3.1 临床和遗传学发现：Sanger测序在两名患病兄弟中确认了ANOS1 c.452G>C（p.Cys151Ser）变异的半合子状态，其母亲和外祖母为杂合子携带者，符合X连锁隐性遗传模式。常规核型分析和阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization, aCGH）结果均正常。Sniffin' Sticks嗅觉测试显示两名患病兄弟的嗅觉识别能力显著受损，而母亲的嗅觉功能在正常范围内。
3.2 ANOS1变异的结构背景：该变异位于WAP结构域内一个高度保守的半胱氨酸残基（Cys151）。WAP结构域以八个半胱氨酸形成的四二硫键核心基序为特征，对结构完整性至关重要。既往研究显示，影响这些半胱氨酸残基的替换可破坏二硫键形成并损害蛋白质稳定性。
3.3 小基因检测：在HEK293T和SH-SY5Y细胞中进行的转染实验显示，野生型和突变型构建体均产生单一预期大小（1130 bp）的产物，表明c.452G>C变异未引起可检测的剪接改变。
3.4 转录组学分析鉴定PROK2失调：RNA-seq分析显示，在选定的候选基因中，大多数（包括ANOS1、CCDC141、DUSP6、SMCHD1和TCF25）在患病者和对照之间无统计学显著的差异表达。ANOS1在所有样本中表达水平极低（TPM<0.02），无法进行可靠的比较分析。相比之下，PROK2在患病个体中显著上调（约1.94倍），且未检测到显著的外显子水平差异。
3.5 外显子水平分析鉴定DUSP6和TCF25的差异外显子使用：DUSP6外显子3（exonic_part E001；校正p=8.82×10-10）显示约2.3倍的使用减少。TCF25中检测到多个外显子区域的差异使用，但变化幅度中等。这些外显子水平差异未伴随一致的基因表达变化。
3.6 qRT-PCR验证PROK2上调但未验证DUSP6改变：qRT-PCR证实PROK2在两名患者中均上调（患者1约1.65倍，患者2约2.98倍），与RNA-seq结果一致。DUSP6在患者和对照中的表达水平相当，未证实差异表达。
3.7 PROK2和DUSP6无剪接异常证据：半定量RT-PCR未显示PROK2或DUSP6在患病者和对照之间存在转录本大小或模式的差异，排除了这些基因的主要剪接缺陷。
3.8 Sanger测序排除PROK2编码区变异：对PROK2基因的Sanger测序未在两名患病个体中鉴定出与参考序列的序列变异，表明PROK2上调与可检测的编码区或剪接位点变异无关。
3.9 ANOS1和PROK2的相互作用网络分析：STRING数据库分析未显示ANOS1和PROK2之间的直接相互作用，但两者均位于一个涉及嗅觉发育和GnRH神经元迁移关键调控因子的共享网络中，包括CHD7、FGFR1、FGF8和PROKR2。
五、讨论与结论
研究人员提出，ANOS1变异（p.Cys151Ser）虽未影响剪接，但其位于WAP结构域内一个结构关键的半胱氨酸基序中，可能影响蛋白质折叠或稳定性。WAP结构域以八个保守半胱氨酸形成四个二硫键为特征，对维持三级结构至关重要。既往KS患者中鉴定的p.Cys163Tyr和p.Cys172Arg变异被预测分别破坏Cys151-Cys163和Cys157-Cys172二硫键，导致WAP结构域错误折叠。因此，p.Cys151Ser替换可能具有类似效应，可能破坏二硫键网络并改变anosmin-1的三维构象，进而影响其与分子伙伴的相互作用。
研究人员强调，RNA-seq和qRT-PCR分析一致显示两名患病个体中PROK2表达上调，且未发现PROK2的编码区或剪接位点变异，也无可变剪接证据，表明观察到的PROK2差异发生在表达水平而非反映原发性PROK2编码或剪接位点缺陷。研究人员提出两种可能的解释：一是PROK2上调可能反映对anosmin-1功能障碍引起的细胞外微环境受损的代偿机制激活；二是ANOS1破坏可能间接影响调控神经发育通路的转录网络，从而改变PROK2表达。
研究人员也指出了研究的局限性：样本量小；使用外周血作为RNA来源，而ANOS1在全血中表达极低（TPM<0.02），无法直接捕获ANOS1功能障碍在疾病相关组织（特别是发育中的嗅觉系统和下丘脑-GnRH神经元轴）中的分子后果；血液采样未严格标准化，昼夜节律、炎症状态、白细胞组成、青春期状态和治疗等因素的贡献无法排除；两名患病个体为同胞，不能视为完全独立的生物学重复。
研究结论：ANOS1相关分子改变可能并非孤立作用，而可能扰动参与嗅觉和GnRH神经元发育的更广泛转录网络。PROK2在两名患病个体中的一致上调可能代表KS相关分子通路之间的潜在汇聚点。研究人员提出一个工作假说：anosmin-1功能受损可能通过共享的细胞外或细胞内信号网络，与PROK2及其他参与嗅觉和神经内分泌发育的基因的继发性转录失调相关联。尽管该假说需要在疾病相关细胞模型中验证，但它为将KS中的原发性遗传发现与下游分子改变联系起来提供了一个合理的框架。
