薄荷油在体外展现抗痉挛与抗炎活性并调节肠道微生物群落组成及产气量

《Frontiers in Pharmacology》：Peppermint oil exhibits antispasmodic and anti-inflammatory properties and alters gut microbial community composition and gas production in vitro

　　

背景：薄荷油（peppermint oil, PMO）是一种草药的药用产品，用于缓解胃肠道轻度痉挛、肠胃气胀和腹痛等症状，尤其适用于肠易激综合征（irritable bowel syndrome, IBS）患者。为更全面地理解PMO在IBS中的多模式效应，本研究旨在确认其抗痉挛和抗炎作用，并在体外评估PMO对人肠道微生物组及微生物产气量的直接效应。方法：为研究PMO（BNO 2910）的解痉活性，研究人员使用了五只雄性豚鼠近端结肠的环形平滑肌条。其抗炎潜力通过脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激的RAW 264.7巨噬细胞进行评估，分别采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和Griess试剂检测肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）分泌量和亚硝酸盐水平（作为一氧化氮（nitric oxide, NO）产生的指标）。对人口肠道微生物组和结肠发酵活性的影响，研究人员在厌氧体外发酵系统中开展评估，该系统接种了六名健康供者的粪便样本，并采用16S rRNA基因测序、基于流式细胞术的细胞计数和产气量测量。结果：PMO对豚鼠结肠组织离体平滑肌条表现出抗痉挛作用，并抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞TNF分泌和NO诱导。此外，PMO显著减少了健康供者粪便样本的微生物产气量，表明在实验条件下微生物发酵活性降低，而α多样性指数（丰富度和均匀度）得以维持甚至增加。在属水平上，PMO对微生物群落组成产生直接影响，抑制了潜在疾病相关微生物（如埃希氏菌-志贺氏菌属Escherichia-Shigella或埃格特菌属Eggerthella）的生长，同时维持甚至增加了健康相关微生物（如布劳特菌属Blautia和粪杆菌属Faecalibacterium）的丰度。结论：除抗痉挛和抗炎作用外，PMO对人肠道微生物组表现出直接效应，包括在体外调节微生物群落和总产气量。为确定所观察到的PMO相关微生物组效应在IBS中的具体相关性，尚需开展进一步的疾病特异性研究。

论文解读文章

一、研究背景与目的

肠易激综合征（irritable bowel syndrome, IBS）是一种常见的肠-脑互动障碍，全球患病率约10%，在发达国家更高。目前IBS尚无特异性诊断测试，诊断主要基于罗马V标准，以反复发作的腹痛或不适伴排便习惯异常（便秘、腹泻或两者交替）为特征，持续数月。其他典型症状包括胃肠道痉挛、腹胀和肠胃气胀。IBS的病理机制尚未完全阐明，目前认为其是多因素相互作用的结果，包括上皮完整性与功能受损、肠道微生物失调、内脏高敏感、肠道运动改变、低度肠道炎症及肠-脑轴异常。鉴于IBS的多因素发病机制，有效治疗需要同时针对多种功能障碍。薄荷油（peppermint oil, PMO）作为解痉药物被多个指南推荐用于IBS治疗，其疗效和安全性已获临床证实，尤其在缓解整体IBS症状和腹痛方面效果显著。PMO的主要活性成分L-薄荷醇可通过减少Ca²⁺内流发挥剂量依赖性抗痉挛作用，此外还具有利胆、消泡、镇痛、抗氧化和抗炎等活性。近年有研究提示PMO可能影响失调的肠道微生物组，尤其当PMO以肠溶制剂给药时，可直接与微生物群落相互作用。然而，PMO与人肠道微生物组之间的潜在相互作用尚未得到充分研究。为更全面地认识PMO在IBS中的多模式效应，本研究聚焦于IBS病理生理中三个核心机制——肠道痉挛、低度炎症和肠道微生物组改变，主要目的是探究PMO对人肠道微生物组的直接影响，同时确认其既有的抗痉挛和抗炎特性。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员首先使用雄性豚鼠近端结肠环形平滑肌条（来自5只豚鼠）进行离体器官浴实验，以评估PMO（BNO 2910）的解痉活性，并采用氯化钾（KCl）诱导参考收缩验证组织活力。抗炎实验采用LPS刺激的RAW 264.7小鼠巨噬细胞，通过ELISA检测肿瘤坏死因子（TNF）分泌量，并使用Griess试剂间接测定一氧化氮（NO）产生。微生物组实验采用经过验证的Colon-on-a-Plate?体外结肠模拟系统（ProDigest，比利时），粪便样本来自六名健康成人供者（年龄18–50岁，体质量指数18.5–24.9 kg/m²，西方饮食模式，无影响肠道微生物组的慢性疾病，采样前四个月未使用抗生素），样本采集经根特大学医院伦理委员会批准。PMO测试浓度设为0.2、2和20 mg/mL，其中2 mg/mL接近基于推荐日剂量估算的理论腔内暴露浓度（1.4–2.2 mg/mL）。微生物群落分析采用16S rRNA基因扩增子测序（V3-V4区，引物341F/785R）结合流式细胞术绝对细胞计数，将相对丰度转换为绝对丰度；产气量通过监测密闭系统内气体压力变化（ΔGas pressure_T48h-T0h）进行测量。差异丰度分析使用MaAslin2包，α多样性指标（丰富度、均匀度、Shannon多样性）基于线性混合效应模型进行统计检验。

三、主要研究结果

3.1 PMO的抗痉挛和抗炎特性得到确认

在离体豚鼠结肠环形平滑肌条实验中，PMO在10和100 μg/mL浓度下显著诱导肌肉松弛（分别较相应二甲基亚砜（DMSO）对照下降13%和24%，p = 0.0281和p < 0.0001），最大效应见于100 μg/mL。所有肌条经KCl诱导收缩证实活力和效应可逆性。在RAW 264.7巨噬细胞中，PMO在5和10 μg/mL浓度下显著抑制LPS诱导的TNF释放（抑制至少10%），并显著抑制NO诱导，10 μg/mL时NO抑制率约达50%。所有测试浓度均无细胞毒性。

3.2 基线微生物群组成存在供者间差异

对六名健康供者基线（0 h）样本进行属水平相对丰度分析，主成分分析（PCA）显示供者间微生物群落组成存在明显差异，前两个主成分解释58%总方差。群落主要由芽孢杆菌门（Bacillota，原Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota，原Bacteroidetes）和放线菌门（Actinomycetota，原Actinobacteria）成员构成，主要属包括Subdoligranum、Agathobacter、Blautia、Faecalibacterium、Bacteroides和Bifidobacterium。

3.3 PMO影响总细菌细胞数、产气量和α多样性

与未处理对照（NSC）相比，最低浓度PMO（0.2 mg/mL）对总细菌细胞数和产气量无显著影响；而2和20 mg/mL PMO导致总细菌细胞数显著减少（两者p = 7.84 × 10^-6），产气量也显著降低（2 mg/mL: p = 1.77 × 10^-9；20 mg/mL: p = 1.68 × 10^-9）。α多样性方面，2 mg/mL PMO显著增加群落丰富度、均匀度和Shannon多样性，而0.2和20 mg/mL浓度下无显著变化；使用稀疏化数据计算时结果一致。

3.4 PMO诱导浓度依赖的微生物群落组成变化

48 h孵育后，2和20 mg/mL PMO处理组的微生物群落图谱与相应NSC明显不同，且更接近孵育前（0 h）的基线图谱，而0.2 mg/mL PMO处理组与NSC相似。在37个通过流行率过滤的属中，18个属在至少一个PMO浓度下表现出显著差异丰度。其中，2和20 mg/mL PMO显著降低大肠埃希菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）和埃格特菌属（Eggerthella）的绝对丰度（q值范围0.001–0.004）；同时，粪杆菌属（Faecalibacterium）和布劳特菌属（Blautia）维持在较高绝对丰度（q值范围0.006–0.010）。供者配对图显示这些效应在多数据供者中方向一致，并非由个别离群样本驱动。基于log2倍数变化的PCA显示，2和20 mg/mL PMO在大多数供者中引发高度相似的定向变化，而0.2 mg/mL PMO处理样本更接近未处理对照。值得注意的是，由于研究将16S rRNA测序与流式细胞术绝对计数结合，观察到的丰度变化反映的是绝对丰度而非仅相对丰度变化，排除了总细菌生物量改变导致的组成性假象。

四、讨论与结论

讨论部分指出，PMO的抗痉挛和抗炎效应在非临床模型中再次得到确认，其解痉机制与Ca²⁺通道拮抗相关，抗炎效应涉及抑制促炎脂质介质（如白三烯B4、前列腺素E2、白细胞介素-1β）和TNF分泌。在微生物组方面，PMO在较高浓度下显著降低总细菌细胞数和产气量，同时保持甚至增加α多样性，提示群落均匀度提高和优势类群减少。PMO抑制了与失调和炎症相关的属（Escherichia-Shigella和Eggerthella），同时维持了具有抗炎和产短链脂肪酸（SCFA）潜力的属（Faecalibacterium和Blautia）的较高丰度。这些变化在绝对丰度层面成立，具有方法学优势。供者间基线差异虽大，但PMO诱导的变化方向在多数供者中一致，且处理组群落更接近基线图谱，提示PMO部分缓解了孵育引起的群落漂移，同时保留供者特异性群落特征。研究局限性包括体外发酵系统、48 h短孵育时间、仅使用健康供者粪便样本以及样本量较小，因此结果属于探索性和假说生成性质，需在更大供者队列、IBS特异性模型和临床试验中验证。

结论部分：PMO（BNO 2910）在非临床模型中表现出显著的抗痉挛和抗炎效应，支持其用于管理IBS相关症状（如腹痛/腹胀）。此外，PMO在健康供者样本中诱导浓度依赖的微生物组相关效应，包括改变微生物群落组成、维持微生物多样性以及减少产气量。这些发现进一步揭示了PMO的多模式药理学特性。虽然所观察到的微生物组相关效应的临床相关性尚待确定，但产气量减少在IBS背景下可能特别值得关注，因为腹胀和腹部不适/疼痛是重要的症状负担。未来临床研究应在IBS患者中进一步探讨这些观察结果。