胸主动脉血管周围脂肪组织中CERS6/C16:0神经酰胺经FPR2/NF-κB信号驱动巨噬细胞炎症促进主动脉夹层

《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》：Elevated CERS6/C16:0 Ceramide in taPVAT Promotes Aortic Dissection by Driving Macrophage Inflammation via FPR2/NF-κB Signaling

　　

背景：血管周围脂肪组织（PVAT）是紧邻主动脉的内分泌微环境。研究人员通过多组学分析发现，在主动脉夹层（AD）小鼠的胸主动脉血管周围脂肪组织（taPVAT）中，神经酰胺合酶6（Cers6）表达上调，且C16:0神经酰胺发生蓄积；然而，其在AD中的作用及潜在机制尚不明确。 方法：通过联合β-氨基丙腈（BAPN）与血管紧张素II（AngII）给药建立小鼠AD模型，随后对taPVAT进行蛋白质组学与定量脂质组学分析。研究人员采用腺相关病毒（AAV）递送技术对taPVAT脂肪细胞中Cers6表达进行局部干预，并在体内给予外源性C16:0神经酰胺。机制研究采用脂肪细胞-骨髓来源巨噬细胞（BMDM）共培养及C16:0神经酰胺刺激的BMDM，结合转录组学、药理学抑制、分子对接、表面等离子体共振（SPR）、细胞热位移分析（CETSA）及小干扰RNA（siRNA）敲降等技术。WRW4干预在体内进行了评估。研究人员使用人taPVAT样本验证CERS6/C16:0神经酰胺的变化及临床相关性。 结果：AD小鼠taPVAT中Cers6选择性上调，并伴随C16:0神经酰胺水平升高。taPVAT脂肪细胞中特异性敲降Cers6可降低AD发生率，并减轻主动脉细胞外基质（ECM）降解和炎症；而Cers6过表达或外源性C16:0神经酰胺则加重疾病。体外实验中，Cers6/C16:0神经酰胺通过甲酰肽受体2（Fpr2）/核因子-κB（NF-κB）信号增强巨噬细胞炎症活化、迁移及基质金属蛋白酶9（Mmp9）表达。WRW4可减轻上述促AD效应。与此一致，人taPVAT中CERS6和C16:0神经酰胺亦升高，且C16:0神经酰胺与主动脉炎症基因表达及胸主动脉最大直径呈正相关。 结论：taPVAT中Cers6驱动的C16:0神经酰胺蓄积通过巨噬细胞Fpr2/NF-κB信号促进AD，增强炎症和ECM降解。靶向taPVAT中的Cers6或阻断Fpr2/NF-κB轴可能提供一种组织聚焦的治疗策略。

一、研究背景与科学问题

主动脉夹层（aortic dissection, AD）是一种灾难性的血管急症，其核心病理过程始于内膜撕裂，血液由此进入中膜并沿主动脉纵轴扩展，形成假腔并破坏主动脉壁的稳定性。AD起病突然，急诊手术仍是主要治疗手段，因此从机制层面识别可干预的分子和细胞事件对于推进AD靶向治疗至关重要。当前主流观点认为，AD的发生和进展源于主动脉壁结构稳态失衡与持续性炎症的耦联。内皮功能障碍促进炎症细胞募集，中膜平滑肌细胞的适应不良表型变化损害血管壁完整性和修复能力，而促炎巨噬细胞的持续浸润则通过炎症介质和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）驱动细胞外基质（extracellular matrix, ECM）降解和重塑，加速弹性蛋白断裂和异常胶原沉积，最终降低主动脉壁弹性和抗张强度。

近年来，机制研究已从以血管壁为中心扩展到血管周围微环境，尤其是血管周围脂肪组织（perivascular adipose tissue, PVAT）。PVAT是包绕绝大多数血管的特化脂肪库，脂肪细胞约占其细胞组成的50%，同时还含有前脂肪细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、神经细胞和基质血管细胞等多种细胞群体。值得注意的是，PVAT与外膜之间缺乏明确的物理屏障，能够以旁分泌方式释放脂肪因子和多种生物活性介质，调节血管张力、内皮功能和局部免疫稳态。PVAT在不同血管床间具有异质性，提示其具有区域特异性生物学效应。在代谢应激下，PVAT可从抗炎分泌谱转变为促炎表型，促进免疫细胞募集和炎症放大。然而，PVAT功能障碍与AD之间的机制联系仍未完全阐明。尽管新兴证据表明PVAT表型重塑、淋巴功能受损及PVAT来源的生物活性介质与主动脉瘤/AD病理相关，但这些PVAT改变如何驱动AD的发生和进展尚未被充分阐明。

为探索PVAT在AD中的潜在作用，研究人员对AD小鼠的胸主动脉血管周围脂肪组织（thoracic aortic PVAT, taPVAT）进行了多组学分析，观察到鞘脂/神经酰胺生物合成通路的显著富集，以及神经酰胺合酶6（ceramide synthase 6, Cers6）及其主要产物C16:0神经酰胺的异常上调，提示PVAT来源的Cers6/C16:0神经酰胺轴可能与AD发病密切相关。既往研究已表明，神经酰胺代谢与炎症、细胞死亡和组织重塑紧密相关，而神经酰胺合酶家族（Cers）通过酰基链长度偏好决定不同神经酰胺种类的选择性蓄积，从而塑造下游应激和炎症反应。其中Cers6优先产生C16神经酰胺。然而，Cers6/C16:0神经酰胺轴在AD中的致病作用以及连接PVAT与主动脉壁重塑的关键机制仍不清楚。

二、研究内容与主要结论

本研究系统探讨了taPVAT来源的Cers6/C16:0神经酰胺轴在AD中的作用，采用多组学分析、局部功能获得与丧失实验、外源性C16:0神经酰胺给药、基于巨噬细胞的机制实验、Fpr2（formyl peptide receptor 2, 甲酰肽受体2）药理学阻断以及人样本验证。研究结果确定了taPVAT来源的Cers6/C16:0神经酰胺-Fpr2/NF-κB（nuclear factor-κB, 核因子-κB）轴是连接PVAT代谢重塑与主动脉炎症、ECM降解和AD进展的关键机制，为AD的发病机制理解从主动脉壁扩展至其周围局部微环境提供了新视角，并提示靶向taPVAT Cers6/C16:0神经酰胺-Fpr2轴可能代表一种潜在的AD药物治疗策略。

三、主要技术方法

研究人员建立了联合β-氨基丙腈（BAPN）和血管紧张素II（AngII）给药的小鼠AD模型。采用基于Pluronic F-127凝胶的局部AAV递送技术，实现taPVAT脂肪细胞中Cers6的特异性敲降和过表达。体外采用3T3-L1成熟脂肪细胞与骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的Transwell非接触共培养体系及C16:0神经酰胺直接刺激BMDM。机制研究综合运用了转录组测序、蛋白质组学、定量脂质组学、分子对接、表面等离子体共振（SPR）、细胞热位移分析（CETSA）、siRNA敲降、药理学抑制（JSH23、百日咳毒素PTX、WRW4）及双荧光素酶报告基因实验。临床验证使用了AD患者和心脏移植供体的胸主动脉壁及周围taPVAT标本。

四、研究结果

1. 1.
   AD小鼠taPVAT中Cers6/C16:0神经酰胺上调

对AD小鼠taPVAT的蛋白质组学分析显示，差异表达蛋白显著富集于神经酰胺代谢过程。热图分析表明Cers6在AD小鼠taPVAT中显著上调，RT-qPCR验证确认Cers6 mRNA水平显著升高，而其他Cers成员（Cers1-5）中仅Cers3下降。Cers6蛋白表达亦升高，且这种上调仅见于taPVAT，在腹股沟白色脂肪组织、附睾白色脂肪组织和棕色脂肪组织中均未观察到。免疫荧光共定位分析显示Cers6与脂肪细胞标志物脂联素显著共定位，表明升高的Cers6信号主要来源于脂肪细胞。定量脂质组学分析显示AD小鼠taPVAT中C16:0和C18:0神经酰胺水平显著升高。

1. 2.
   taPVAT脂肪细胞靶向Cers6敲降减轻AD发展并减少主动脉ECM降解和炎症

通过局部应用AAV-Fabp4-sh-Cers6实现taPVAT脂肪细胞中Cers6的特异性敲降，验证显示Cers6表达仅在taPVAT中显著降低，且仅影响PVAT脂肪细胞。Cers6敲降显著降低AD发生率、改善生存率、减轻主动脉弓扩张，同时改善主动脉结构保存、减少弹性纤维断裂和胶原沉积，降低巨噬细胞浸润和Mmp9表达，减少Col1a1和Fn1沉积，并降低主动脉组织中Il-6、Tnf-α和Il-1β水平。定量脂质组学确认Cers6敲降降低了taPVAT中C16:0神经酰胺丰度。雌性小鼠中亦观察到一致的保护效应。

1. 3.
   taPVAT脂肪细胞靶向Cers6过表达加重AD发展并促进主动脉ECM降解和炎症

局部应用AAV-Fabp4-OE-Cers6实现Cers6过表达，验证显示Cers6表达仅在taPVAT中显著升高。Cers6过表达显著增加AD发生率、降低生存率、加重主动脉弓扩张，并导致更严重的主动脉结构破坏、弹性纤维断裂增加和胶原沉积加重，同时增加巨噬细胞浸润、Mmp9表达、Col1a1和Fn1沉积以及主动脉炎症因子水平。

1. 4.
   腹腔注射C16:0神经酰胺加重AD发展并促进主动脉ECM降解和炎症

外源性C16:0神经酰胺给药显著增加AD发生率、降低生存率、加重主动脉弓扩张，并加剧主动脉结构破坏、弹性纤维断裂和异常胶原沉积，同时增加巨噬细胞浸润、Mmp9表达和炎症因子水平。此外，C16:0神经酰胺处理增加主动脉内质网应激（p-Eif2α/Eif2α比值升高、Atf4表达增加）和凋亡（TUNEL阳性细胞增加）。

1. 5.
   Cers6/C16:0神经酰胺增强巨噬细胞炎症、Mmp9产生和迁移能力

体外共培养实验表明，Cers6过表达的脂肪细胞显著增加共培养体系中C16:0神经酰胺水平，并增强BMDM中促炎因子Il-6、Tnf-α、Il-1β和Mmp9的转录和分泌，同时增强BMDM迁移能力。C16:0神经酰胺直接刺激同样显著增强BMDM的促炎反应、Mmp9产生和迁移能力，而抗炎因子Il-4、Il-10和Tgf-β无明显变化。

1. 6.
   C16:0神经酰胺通过NF-κB通路促进巨噬细胞炎症、Mmp9产生和迁移能力

转录组分析显示差异表达基因显著富集于NF-κB通路。C16:0神经酰胺处理显著促进p65核转位和p65磷酸化增加。NF-κB抑制剂JSH23显著逆转C16:0神经酰胺诱导的促炎反应、Mmp9上调和迁移能力增强，并抑制p65磷酸化和核转位。此外，C16:0神经酰胺直接促进小鼠主动脉内皮细胞和血管平滑肌细胞凋亡。

1. 7.
   C16:0神经酰胺通过Fpr2/NF-κB通路促进巨噬细胞炎症、Mmp9产生和迁移能力

在候选受体P2y6、Cysltr2和Fpr2中，仅Fpr2 mRNA和蛋白水平在C16:0神经酰胺处理后显著上调。分子对接提示C16:0神经酰胺与Fpr2存在潜在相互作用，细胞热位移分析显示C16:0神经酰胺增强Fpr2热稳定性，表面等离子体共振证实二者直接结合（KD≈20.3 μM）。Fpr2 siRNA敲降显著减弱C16:0神经酰胺诱导的炎症因子表达和分泌、Mmp9上调、迁移增强以及p65核转位和磷酸化增加。双荧光素酶报告实验显示C16:0神经酰胺增加Fpr2启动子活性，而JSH23可抑制此效应，提示存在Fpr2/NF-κB正反馈调控机制。体内验证显示，AD过程中主动脉组织Fpr2蛋白水平升高、p65磷酸化增加和核转位增强，这些变化被taPVAT脂肪细胞Cers6敲降显著抑制。机制分析表明，百日咳毒素（PTX）阻断Gi蛋白信号可显著抑制C16:0神经酰胺诱导的p65磷酸化和核转位、炎症因子转录及细胞内cAMP变化，而β-arrestin siRNA敲降无显著影响，提示C16:0神经酰胺主要通过Fpr2介导的经典GPCR信号而非β-arrestin偏向信号激活NF-κB。

1. 8.
   Fpr2拮抗剂WRW4减轻taPVAT脂肪细胞Cers6过表达诱导的AD发展

在Cers6过表达背景下，WRW4治疗显著降低AD发生率、改善生存率、减轻主动脉弓扩张，并改善主动脉结构保存、减少弹性纤维断裂和胶原沉积，降低巨噬细胞浸润、Mmp9表达、Col1a1和Fn1沉积及炎症因子水平。WRW4还显著抑制Fpr2蛋白上调、p65磷酸化和核转位。

1. 9.
   AD患者taPVAT中CERS6/C16:0神经酰胺升高并与主动脉炎症和最大直径正相关

人taPVAT样本验证显示，AD患者taPVAT中CERS6蛋白和mRNA水平显著升高，CERS5表达下调，CERS6主要定位于PVAT脂肪细胞。定量脂质组学显示AD患者taPVAT中C16:0神经酰胺水平显著升高。相关性分析显示，C16:0神经酰胺水平与主动脉组织中IL-6、TNF-α、IL-1β和MMP9 mRNA水平及胸主动脉最大直径呈正相关。

五、结论

taPVAT中Cers6驱动的C16:0神经酰胺蓄积通过巨噬细胞Fpr2/NF-κB信号促进AD，增强炎症和ECM降解。靶向taPVAT中的Cers6或阻断Fpr2/NF-κB轴可能提供一种组织聚焦的治疗策略。这些发现将AD发病机制的理解从主动脉壁扩展至其周围局部微环境，提示靶向胸主动脉血管周围脂肪组织Cers6/C16:0神经酰胺-Fpr2轴可能代表一种潜在的AD药物治疗策略。