苦参中Kurarinol A通过TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制肝星状细胞活化的抗肝纤维化机制研究

《Frontiers in Pharmacology》：Kurarinol A from Sophora flavescens suppresses hepatic stellate cell activation via the TLR4/MyD88/NF-κB pathway

　　

摘要专业翻译 引言： 苦参（Sophora flavescens）在中医药及苗、蒙、彝民族医药中传统上用于肝胆疾病，但其生物活性黄酮成分及作用机制尚不完全清楚。本研究探讨了苦参乙酸乙酯部位（ethyl acetate fraction，EAF）的抗肝纤维化疗效、机制及靶点，并研究了其关键薰衣草基黄酮Kurarinol A（KA）。 方法： 建立CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型，通过H&E/Masson染色及血清ALT/AST和肝组织α-SMA/fibronectin/Hyp检测评估肝损伤和纤维化程度。建立TGF-β1激活的LX-2细胞模型，通过MTS、划痕愈合和Annexin V-FITC/PI实验评估细胞活力、迁移和凋亡。采用转录组学、KEGG分析、分子对接、分子动力学（MD）模拟、CETSA及MyD88敲低/过表达实验探究其潜在机制。 结果： 体内实验中，EAF（50和100 mg/kg）减轻了CCl4诱导的肝损伤和纤维化，并降低了纤维化血清生物标志物水平。体外实验中，KA显著抑制LX-2细胞活化，IC50为12.65 μM（n = 3），抑制细胞增殖和迁移并诱导凋亡。KA的抗纤维化活性仅在体外得到验证，其对EAF体内疗效的贡献仍属推断而非直接证实。机制上，KA下调TLR4/NF-κB通路关键信号分子，从而阻断通路激活。分子对接、MD模拟和CETSA支持KA与MyD88之间存在直接相互作用。MyD88敲低和过表达实验进一步支持MyD88作为介导KA抗纤维化活性的候选分子靶点。 结论： EAF在体内发挥抗纤维化作用，KA在体外表现出一致的抗纤维化活性。研究结果支持MyD88作为介导KA体外抗纤维化活性的潜在分子靶点，其作用通过TLR4/NF-κB信号通路实现。这些发现不仅验证了苦参在肝胆疾病中的传统应用，也为以MyD88为靶点的抗纤维化药物开发提供了有前景的候选化合物，值得进一步先导优化。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

肝纤维化是慢性肝损伤后肝脏病理性修复的结果，以细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积为特征，若不干预可进展为肝硬化甚至肝细胞癌。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的过度活化增殖是肝纤维化进展的核心事件。TGF-β作为核心促纤维化细胞因子可直接激活HSC，而脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）通过激活Toll样受体4（TLR4）信号进一步放大炎症级联反应并与TGF-β通路交叉激活，共同推动纤维化进程。髓样分化因子88（MyD88）作为TLR4和IL-1R信号通路的核心衔接蛋白，是驱动NF-κB和MAPK介导的促炎促纤维化反应的关键节点，已成为肝纤维化治疗的有前景靶点。然而，目前唯一进入临床试验的MyD88靶向候选药物TJ-M2010-5在成药性和安全性方面存在局限，亟需开发靶向该信号级联的新型治疗药物。

苦参（Sophora flavescens Ait.）为豆科植物，首载于《神农本草经》，在中医药及苗、蒙、彝等民族医药中均有治疗肝胆疾病的传统应用记录。现代药理学研究已证实其生物碱和黄酮类成分具有保肝活性，但具体功能成分和详细分子机制尚不清楚。研究人员前期已证实苦参中主要薰衣草基黄酮Kurarinol A（KA）通过TGF-β/Smad信号通路抑制HSC活化和肝纤维化。本研究旨在进一步探讨KA是否同时调节TLR4/MyD88/NF-κB通路，并系统验证MyD88是否为KA抗纤维化的核心分子靶点。

二、研究设计与主要技术方法

本研究采用严格的层级化设计：苦参乙酸乙酯部位（ethyl acetate fraction，EAF）用于CCl₄诱导小鼠肝纤维化模型的体内抗纤维化评价，纯化KA用于TGF-β1刺激LX-2细胞模型的体外功能与机制研究。主要关键技术方法包括：①动物实验：SPF级雄性C57BL/6小鼠（6–8周龄，18～22 g，由贵州医科大学实验动物中心提供），随机分为5组（n = 8），腹腔注射10% CCl₄橄榄油溶液（5 mL/kg，每周2次，持续2周）建立模型，随后灌胃给药2周；②细胞实验：MTS法检测细胞增殖，划痕实验评估迁移，Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测凋亡；③RT-qPCR和Western blot检测纤维化及通路相关基因和蛋白表达；④转录组测序（Illumina NovaSeq 6000平台，150 bp双端测序）结合KEGG和GO富集分析；⑤分子对接（Schr?dinger Glide SP）和100 ns分子动力学模拟（Desmond）分析KA与MyD88 TIR结构域（PDB ID: 2Z5V）的结合模式；⑥细胞热位移分析（CETSA）验证KA与MyD88的直接结合；⑦MyD88敲低（shRNA）和过表达（pcDNA3.1-MyD88质粒）实验进行功能验证。

三、研究结果

3.1 苦参EAF发挥显著的抗肝纤维化作用

在CCl₄诱导的肝纤维化小鼠模型中，EAF（50和100 mg/kg）剂量依赖性地减轻肝组织病理损伤和胶原沉积，降低血清AST、ALT及肝组织羟脯氨酸（Hyp）水平，并下调α-SMA和纤连蛋白（fibronectin，FN）蛋白表达，高剂量组（100 mg/kg）效果最为显著。

3.2 鉴定EAF中抗肝纤维化活性化合物

通过对苦参中35个化合物进行MTS活性筛选，11个化合物表现出对TGF-β1激活LX-2细胞的抗增殖活性，IC₅₀介于4–40 μM之间。其中KA（化合物1）的IC₅₀为12.65 μM，在11个活性化合物中效力排名第三。KA因具有罕见的薰衣草基黄烷酮独特化学骨架且前期研究提示其可调节肝脏细胞炎症信号，被优先选作深入机制研究对象。

3.3 KA抑制活化LX-2细胞增殖和迁移并促进凋亡

KA（2.5、5、10 μM）剂量依赖性地抑制TGF-β1激活LX-2细胞的活力，降低FN mRNA表达，在24和48 h抑制细胞迁移。流式细胞术显示KA处理组凋亡细胞比例从2.5 μM时的10.3%增加至10 μM时的19.9%，模型对照组为6.8%，水飞蓟宾组为13.6%，证实KA通过诱导凋亡减少活化HSC群体。

3.4 KA降低TGF-β1刺激LX-2细胞中纤维化标志物表达

RT-qPCR和Western blot结果显示，KA（2.5、5、10 μM）浓度依赖性地降低TGF-β1诱导的FN、α-SMA和Collagen I的mRNA和蛋白表达水平。

3.5 转录组学探索KA抑制LX-2细胞活化的机制

主成分分析显示对照组、模型组和KA处理组基因表达谱明显分离。TGF-β1刺激上调444个基因、下调2947个基因；KA处理调节216个上调基因和119个下调基因，其中34个重叠靶基因被KA逆转。KEGG富集分析将差异基因关联至Toll样受体信号通路等多个通路，GO分析提示这些基因涉及多种生物学过程、细胞组分和分子功能。

3.6 KA通过TLR4/NF-κB/MyD88炎症信号通路抑制LX-2细胞活化

LPS（100 ng/mL）刺激显著升高LX-2细胞中TLR4、MyD88、TIRAP、TRAF6、TAK1、NF-κB、IL-1β和TNF-α的mRNA水平，KA（2.5、5、10 μM）剂量依赖性地降低这些基因的表达。Western blot在蛋白水平证实了相同趋势。

3.7 KA与MyD88分子对接良好且分子动力学模拟中结合稳定

分子对接显示KA与MyD88的结合能为?8.573 kcal/mol，结合位点涉及Arg251、Leu252和Phe270三个氢键相互作用及Leu241、Lys250、Ile253、Phe270、Ile271、Ala292和Leu295等残基的十个疏水相互作用位点。100 ns分子动力学模拟中，蛋白-配体RMSD在初始20 ns波动后达到平台期，表明复合物达到稳定状态，KA稳定结合于MyD88结合口袋。

3.8 KA与MyD88结合显著增强靶蛋白热稳定性

CETSA结果显示，在37 °C至57 °C温度范围内，KA处理组MyD88的热稳定性高于DMSO对照组；在55 °C固定温度下，KA以浓度依赖性方式增强MyD88的热稳定性。

3.9 MyD88是KA抗肝纤维化的核心药物靶点

MyD88敲低实验中，筛选出的shMyD88-96病毒株实现最有效的MyD88蛋白敲低。与模型组相比，MyD88敲低显著下调α-SMA、FN和Collagen I表达；在MyD88敲低细胞中，KA处理未能进一步降低纤维化标志物及下游蛋白（TAK1、p65、TNF-α）表达，表明KA的抗纤维化作用依赖于MyD88。MyD88过表达实验中，过表达MyD88显著促进纤维化反应，而KA处理可逆转MyD88过表达驱动的促纤维化效应，降低α-SMA、FN和Collagen I表达。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，TLR4/NF-κB信号通路在肝纤维化炎症反应中发挥关键作用，MyD88作为TLR4下游关键衔接蛋白位于多条炎症信号通路的汇聚点，靶向MyD88可能比靶向上游受体或下游激酶实现更高效的通路阻断。研究通过转录组学、分子动力学模拟和CETSA获得了一致性证据支持KA与MyD88直接相互作用并调节TLR4/NF-κB信号通路。KA的双重抗炎和抗纤维化作用体现在其同时抑制TLR4/MyD88/NF-κB轴和TGF-β/Smad信号通路。基因敲低和过表达实验进一步支持MyD88是KA发挥抗纤维化作用的功能靶点。与前期研究相比，本研究将KA的药理活性从急性肝损伤扩展至肝纤维化模型，并将信号通路从TLR2扩展至TLR4/MyD88/NF-κB轴，首次系统揭示了KA靶向MyD88的分子机制。

研究局限性包括：体内药效数据来自EAF而非KA纯品；CCl₄诱导4周模型属急性-亚急性肝损伤模型；KA与MyD88相互作用的关键氨基酸残基尚需定点突变实验确认；部分定量分析仅基于3个生物学重复；KA的药代动力学性质尚未完全阐明，包括口服EAF后肝脏暴露量未估算；仅使用雄性小鼠；未进行KA对其他含TIR结构域衔接蛋白的选择性评估；未进行定量HPLC纯度测定及PAINS排除反筛和直接生物物理结合实验（MST/SPR/ITC）。

研究结论： 本研究将传统中医药与现代分子药理学相结合，通过整合转录组学、计算生物学和功能基因组学阐明KA的抗纤维化机制。研究人员将MyD88鉴定为候选分子靶点，并证明KA以MyD88依赖性方式抑制TLR4/NF-κB信号通路。该工作不仅深化了对KA机制的理解，也为系统性天然产物研究提供了参考范式。然而，KA的临床转化仍需进一步的药代动力学优化、多种肝纤维化模型中的疗效验证，以及基于结构的修饰以提高口服生物利用度和靶点选择性。