鼻内递送腺病毒载体神经氨酸酶疫苗诱导局部与系统性免疫及甲型流感病毒同亚型保护效应

《Frontiers in Immunology》：Intranasal adenoviral neuraminidase vaccine induces local and systemic immunity and homosubtypic protection against influenza A viruses

　　

摘要 引言： 甲型流感病毒血凝素（HA）的快速抗原漂移限制了当前以HA为核心的疫苗的有效性。为应对这一挑战，研究人员评估了表达神经氨酸酶（NA）的重组人源腺病毒（HAd）和牛源腺病毒（BAd）载体作为诱导广泛保护性黏膜免疫的替代策略。 方法： 研究人员以BALB/c小鼠为模型，经鼻内途径免疫基于HAd或BAd载体表达的N9 NA。在局部和系统性水平定量检测了抗原特异性细胞与体液免疫应答。随后，监测免疫小鼠在致死性同亚型或异亚型（Group 1 [H1N1] 和 Group 2 [H3N2]）甲型流感病毒攻击后的存活率与保护效力。 结果： 两种载体的鼻内免疫均诱导了强烈的系统性IgG和黏膜IgA应答，以及稳健的系统性与局部T细胞激活，提供了针对致死性同亚型攻击的完全保护。值得注意的是，BAd-N9NA载体诱导的黏膜和细胞应答强于其HAd对应物。在交叉保护方面，基于N9的疫苗接种对Group 2（H3N2）病毒提供了部分保护，但对Group 1（H1N1）病毒无效。 讨论： 这些发现表明，表达NA的腺病毒载体能够诱导有效的黏膜和细胞免疫，从而介导强大的同亚型保护。尽管N1、N2和N9亚型之间存在保守的结构表位，但异亚型保护作用有限，仍受限于系统发育谱系和序列保守性。此外，这些结果凸显了BAd平台作为最大化NA特异性免疫原性的高效递送系统的价值，为设计基于NA的广谱保护性疫苗提供了重要见解。

研究背景与目的

甲型流感病毒持续构成全球重大健康负担，引发季节性流行以及来自禽流感病毒储库（如H5N1、H7N9和H9N2）的反复人畜共患外溢事件。近期在家牛中检测到禽流感感染进一步引发了对宿主范围扩大和跨物种易感性的担忧。当前的疫苗接种策略主要靶向血凝素（HA），旨在诱导阻断病毒进入的中和抗体。然而，HA频繁发生抗原漂移和偶尔的抗原转换，导致疫苗株与流行株之间的反复错配。这些局限性凸显了对下一代疫苗的需求，包括那些靶向其他病毒抗原的疫苗。

神经氨酸酶（NA）作为第二个主要的病毒表面糖蛋白，正日益被认为是前景良好的补充性或替代性疫苗抗原。NA在病毒颗粒上的丰度较低，典型的HA与NA比例约为4:1。这种结构失衡导致了HA的免疫优势性和NA特异性免疫的代表性不足。重要的是，NA在不同型和亚型间更为保守，并且针对NA的抗体可以抑制病毒释放、限制传播、通过空间位阻阻碍附着，并介导Fc依赖性效应功能，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。因此，通过疫苗接种靶向NA可以激发自然感染或常规HA聚焦疫苗接种后很少实现的保护机制。

多种疫苗平台，包括灭活病毒、重组蛋白和mRNA疫苗，已证明NA特异性免疫可以提供有意义的交叉保护，并且黏膜NA疫苗接种已被明确显示可增强呼吸道保护并减少病毒传播。然而，产生如此强的黏膜应答和稳健的细胞免疫仍是基于NA的疫苗面临的关键挑战。重组腺病毒（Ad）载体非常适合这一角色，因为它们能诱导强效的体液和T细胞应答，并且当经鼻内递送时，能有效刺激呼吸道中的黏膜IgA产生和组织驻留免疫。除了已建立的人腺病毒5型（HAd-5）载体外，研究人员的实验室还开发了一种牛腺病毒3型（BAd-3）平台，在临床前研究中显示出增强的免疫原性，为人类和非人类Ad载体的并列比较提供了独特机会。

NA蛋白在系统发育上分为Group 1（包括N1）和Group 2（包括N2和N9）。鉴于H7N9持续存在的动物源性和大流行威胁，研究人员选择N9作为靶点，以测试其是否能引起针对N2（季节性H3N2或动物源性H9N2）的组内保护，或针对N1（季节性H1N1或动物源性H5N1）的跨组保护。本研究构建了表达A/Shanghai/2/2013(H7N9) NA基因的重组HAd和BAd疫苗，评估其诱导体液和细胞免疫的能力，并评估其对同亚型和异亚型病毒攻击的保护效果。

主要关键技术方法

1. 1.
   腺病毒载体构建与生产：采用Cre重组酶介导的位点特异性重组技术在人胚肾293Cre细胞中生产HAd载体（HAd-N9NA, HAd-N1NA, HAd-N2NA, HAd-H7HA）；采用I-SceI介导的基因组释放技术，在BHH/F5-I-SceI细胞中生产BAd载体（BAd-N9NA, BAd-H7HA）及空载体对照。所有载体均经氯化铯密度梯度超速离心纯化并通过噬斑测定法滴定。
2. 2.
   动物实验模型：选用雌性BALB/c小鼠（来源于Jackson Laboratory），采用初免-加强方案，经鼻内途径免疫，剂量为3×10⁷ PFU。分别进行同亚型（H7N9）和异亚型（H1N1、H3N2）致死性攻毒实验，监测体重变化和生存率。
3. 3.
   免疫学检测：
   • •
     体液免疫：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清和肺洗液中NA特异性IgG、IgG₁、IgG_2a和IgA抗体滴度；采用B细胞酶联免疫斑点试验（ELISpot）检测骨髓和脾脏中抗体分泌细胞（ASC）。
   • •
     细胞免疫：采用流式细胞术分析脾脏、纵隔淋巴结（MLN）和肺部CD4⁺和CD8⁺ T细胞中IFN-γ、IL-2和TNF-α的表达；采用T细胞ELISpot检测脾细胞中IFN-γ和IL-2分泌细胞频率。
   • •
     功能分析：采用病毒微量中和试验（VN）评估血清中和抗体滴度。

研究结果

3.1 HAd-N9NA诱导强烈的体液免疫

研究人员构建了HAd载体并通过免疫印迹验证了NA蛋白的表达。在BALB/c小鼠中进行初免-加强免疫后，与HAd-H7HA相比，HAd-N9NA诱导了显著更高的抗H7N9 IgA抗体分泌细胞（ASC）和NA特异性IgG ASC。两种疫苗均诱导了高水平的H7N9结合性IgG。HA免疫产生了更高的中和滴度，而NA免疫在体外表现出可检测的复制限制活性。

3.2 HAd-N9NA疫苗接种诱导强效的细胞免疫应答

通过流式细胞术分析发现，HAd-N9NA和HAd-H7HA均在脾脏、MLN和肺部诱导了强烈的H7N9特异性CD4⁺ T细胞应答。然而，CD8⁺ T细胞的激活模式不同：HAd-H7HA在所有组织中诱导了强烈的CD8⁺ T细胞应答，而HAd-N9NA主要在MLN中诱导了CD8⁺ T细胞应答。

3.3 HAd-N9NA提供完全的同亚型保护但有限的异亚型保护

在H7N9致死性攻毒实验中，HAd-N9NA和HAd-H7HA均提供了完全保护，防止了体重下降和死亡。空载体对照组也有60%的存活率，表明载体本身具有非特异性保护效应。在异亚型攻毒中，HAd-N1NA对H1N1提供完全保护，而HAd-N9NA对H1N1无效。对H3N2，HAd-N2NA提供完全保护，而HAd-N9NA提供了60%的部分保护。

3.4 BAd-N9NA相较于HAd-N9NA诱导增强的体液和细胞免疫

研究人员构建了BAd-N9NA并与HAd-N9NA进行了头对头比较。结果显示，BAd-N9NA在血清和肺洗液中诱导了更强的系统性抗体（IgG, IgG₁, IgG_2a）和黏膜IgA应答。ELISpot分析证实，BAd-N9NA诱导了更高频率的IFN-γ和IL-2分泌性T细胞。尽管免疫应答更强，但BAd-N9NA提供的保护模式与HAd-N9NA相同：对H7N9完全保护，对H3N2部分保护，对H1N1无保护。

讨论与结论

本研究的核心创新在于直接比较了HAd-5和BAd-3平台。BAd平台具有绕过预存抗HAd免疫力、利用唾液酸受体而非CAR进入细胞、以及在肺部等组织中有更好的生物分布和持久性等优势。结果表明，BAd-N9NA诱导了比HAd-N9NA更强的黏膜体液和系统性细胞免疫应答，但这些免疫学优势并未转化为改善的异亚型保护，这强化了一个概念：保护广度受限于抗原相似性而非载体效力。

研究人员指出，NA亚型分为两个主要系统发育群：Group 1（包括N1）和Group 2（包括N2和N9）。这解释了为什么基于N9的疫苗能对同为Group 2的H3N2提供部分交叉保护，而对属于Group 1的H1N1无效。序列比对也支持这一结论，即进化分歧超出了有效交叉保护所需的阈值。因此，要实现广泛的NA基础保护，可能需要包含来自两个系统发育群的NA抗原的多价或多嵌合疫苗设计。

研究结论：本研究的发现表明，腺病毒载体化的NA疫苗通过产生黏膜IgA、系统性IgG和强效CD4⁺ T细胞应答的协同组合，提供了稳健的同亚型保护。BAd平台进一步放大了这些应答，代表了用于黏膜呼吸道疫苗的一种有前景的递送系统。重要的是，N9NA Ad疫苗接种提供了强大的同亚型保护，但组内异亚型保护有限。展望未来，虽然表达NA的Ad载体擅长促进同亚型免疫，但其有限的组内异亚型保护强调它们最适合作为多价或多抗原流感疫苗策略中的一个有前景的组成部分。未来的研究应探索将NA与其他保守靶点如M2e或NP相结合，或在统一平台中共递送HA和NA，以建立不易受单一病毒蛋白抗原漂移影响的多层保护。