Selinexor在BRAFV600E驱动的儿童低级别胶质瘤3D培养模型中的细胞毒性作用及联合MEK抑制策略

《Acta Neuropathologica Communications》：Cytotoxic activity of selinexor in BRAFV600E-driven pediatric low-grade glioma 3D cultures

　　

儿童低级别胶质瘤（pediatric low-grade gliomas，pLGGs）是最常见的儿童原发性脑肿瘤，常携带激活RAS/MAPK通路的改变，包括BRAF^V600E突变。尽管MEK抑制剂（MEK inhibitors，MEKi）显示出临床活性，但反应常不完全，且肿瘤在停药后常再生长，凸显了对能诱导持续消退疗法的需求。为系统识别细胞毒性治疗方案，研究人员首先在BRAF^V600E突变的BT40三维（3D）多细胞聚集体中筛选了87种临床相关药物，随后在BRAF^V600E突变的DKFZ-BT314球体（增殖ON态和衰老OFF态）以及新鲜pLGG组织培养中评估了优先选择的XPO1靶向策略。基于机器学习分析的高内涵成像（high-content imaging）将XPO1抑制鉴定为跨模型的脆弱点。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的选择性XPO1抑制剂selinexor单药或与MEKi联合均具有活性。MEK-XPO1联合抑制使活性3D培养面积减少超过30%，并在换液后至少10天内抑制再生长。DRAQ7阳性和caspase-3/7活化证明3D培养中发生细胞死亡，而互补的二维（2D）分析显示PARP裂解、核碎裂和caspase活化。对多形性黄色星形细胞瘤（pleomorphic xanthoastrocytoma）患者样本和BRAF^V600E诱导衰老模型的转录组学分析揭示了MAPK、TGFβ、TP53和FOXO通路基因以及抗凋亡BCL2家族成员（包括MCL-1）的上调。XPO1抑制降低MCL-1蛋白水平，与抗凋亡信号的中断一致。来自LOGGIC Core BioClinical Data Bank的20例患者新鲜肿瘤组织的离体药物敏感性分析（ex vivo drug sensitivity profiling）显示，在临床可达到的浓度下对XPO1抑制具有敏感性。在一项探索性BT40斑马鱼胚胎异种移植实验中，与溶剂处理相比，48小时联合治疗在数值上减弱了肿瘤生长，但差异无统计学显著性。总体而言，这些发现支持XPO1抑制（单药或联合MEK抑制）作为BRAF^V600E驱动的pLGG的候选治疗策略，值得进一步临床前评估。

儿童低级别胶质瘤（pLGG）是儿童最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，多数病例携带RAS/MAPK通路激活改变，其中BRAF^V600E突变与较高进展风险相关。MEK抑制剂（MEKi）和BRAF抑制剂虽在临床中表现出一定活性，但反应常不完全，停药后肿瘤往往再生长，因此亟需能诱导持续消退的细胞毒性方案。选择性核输出抑制剂selinexor已获FDA批准用于多种成人肿瘤，且可穿透血脑屏障，但尚未在pLGG中与MAPK通路抑制系统联用。研究人员设计了一个从筛选到验证的分阶段策略，以寻找增强MEKi疗效的细胞毒性联合伙伴。

研究人员首先在BRAF^V600E突变的BT40 3D多细胞聚集体中筛选了87种临床相关药物，识别出XPO1抑制为候选脆弱点；随后在患者来源的DKFZ-BT314球体（增殖和衰老状态）及新鲜pLGG组织培养中验证，并通过20例患者离体药物敏感性分析提供患者来源证据。结果显示selinexor单药或联合MEKi可诱导凋亡、抑制再生长，机制上与降低抗凋亡蛋白MCL-1有关。该研究首次提出MEK-XPO1联合抑制作为BRAF^V600E驱动pLGG的候选治疗策略，为后续临床前评估奠定了基础。

主要技术方法：研究使用患者来源细胞系BT40（BRAF^V600E突变、CDKN2A缺失）和DKFZ-BT314（BRAF^V600E突变，可通过多西环素诱导SV40大T抗原切换增殖ON态或衰老OFF态），以及来自LOGGIC Core BioClinical Data Bank和INFORM项目的20例pLGG新鲜组织培养样本。关键方法包括：TMRE活细胞荧光染色结合高内涵成像和CellProfiler自动图像分析，定量3D培养活性面积变化；CellTiter-Glo检测代谢活性；DRAQ7染色、caspase-3/7活性测定、Western blot检测凋亡标志物；利用R2平台和INFORM数据集进行转录组差异表达分析；离体药物敏感性分析；斑马鱼胚胎异种移植实验。

研究结果：

1. 高内涵成像筛选在BT40 BRAF^V600E细胞中鉴定出有利的MEK抑制剂联合伙伴
通过测量TMRE阳性3D培养面积变化，发现binimetinib和trametinib在临床浓度下主要稳定面积，需要更高浓度才使面积缩小超过30%。将87种药物与IC25浓度MEKi联合处理后，分别得到25个和28个候选，其中21个重叠，涉及HDAC抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、BCL-2家族、BRAF和mTOR抑制剂等已知类别，并发现新的XPO1抑制剂selinexor。

2. MEK与XPO1联合抑制减少增殖和衰老pLGG模型中的活性3D培养面积
在DKFZ-BT314_ON、OFF和BT40模型中，selinexor（≤1000 nM，临床Cmax约1071 nM）单药或联合binimetinib均显示活性，联合效应维持或增强。BCL-XL抑制剂在三个模型均有效，尤其降低衰老模型代谢活性；BRAF抑制剂在BT40中杀伤明显，但在球体模型中较弱；mTOR抑制剂仅抑制生长而不缩小面积；长春碱在增殖细胞中有效。在KIAA1549::BRAF融合的BT317_OFF衰老模型中，selinexor联合mirdametinib或ulixertinib也增强效果。

3. MEK与XPO1联合抑制在3D培养和互补2D分析中诱导细胞死亡
在3D培养中，selinexor单药或联合MEKi增加caspase-3/7活性和DRAQ7阳性细胞；2D单层细胞中观察到DRAQ7阳性、胰蓝排斥、核碎裂和caspase-3/7活性增加，PARP和BID裂解支持凋亡。BLISS分析显示selinexor或navitoclax与MEKi存在协同作用。这些结果证明活性面积下降反映细胞死亡而非单纯代谢抑制。

4. XPO1抑制单药或联合MEK抑制在体外抑制3D培养和患者来源新鲜组织肿瘤样生长；斑马鱼异种移植探索性评估
在动态on/off治疗实验中，selinexor单药在DKFZ-BT314_ON/OFF中产生持续部分反应；trametinib单药停药后趋向再生长，而selinexor（单药或联合）在换液后维持面积缩小至少12天。HSA分析显示临床浓度下联合活性，在衰老细胞中最显著。离体DSP显示新鲜pLGG组织对selinexor敏感，20例中5例（25%）在临床Cmax下抑制>50%，与navitoclax应答高度相关。斑马鱼异种移植中，联合治疗48小时后肿瘤生长数值低于溶剂组，疾病控制率53%，但未达统计显著（ANOVA p=0.058）。

5. selinexor与MEKi联合降低抗凋亡BCL-2家族成员MCL-1
基因表达分析显示，衰老MAPK驱动的LGG模型和PXA患者样本中MCL1和BCL2L1表达较高，而BH3-only促凋亡基因（BIM、NOXA）表达未上调。PXA样本富集衰老标志、p53/FOXO靶基因和MAPK激活特征。Western blot显示selinexor降低MCL-1蛋白水平，单独处理降至0.5倍（BT40）或0.4倍（DKFZ-BT314_OFF），联合binimetinib降至0.1倍或0.01倍；但BCL-XL水平不变。

讨论部分指出，现有MEKi/BRAFi单药难以获得完全缓解，需要细胞毒性联合方案；基于TMRE的高内涵成像优于代谢测定，可区分细胞抑制与杀伤。已证实BCL-XL抑制剂作为衰老靶向策略有效；mTOR抑制剂主要表现为细胞抑制。新发现的XPO1抑制在多个模型中一致有效，但斑马鱼实验仅48小时，未达显著，需长期、充分把握度的动物模型。机制上，XPO1抑制导致肿瘤抑制因子核滞留并减少MCL-1翻译，联合MEK抑制进一步降低MCL-1，从而恢复凋亡能力。第二代替案eltanexor已进入临床，未来需进一步验证。

结论翻译：研究人员利用荧光支持的高内涵成像，在增殖和衰老的pLGG 3D培养模型中系统评估了MEK抑制联合细胞毒性药物的方案。该测定重现了MEK与BCL-XL联合抑制的活性，并鉴定MEK-XPO1联合抑制为替代候选策略。DRAQ7和caspase-3/7测量直接证明治疗诱导的细胞死亡，互补2D实验表征了凋亡信号。在紧密的、患者来源的DKFZ-BT314球体模型以及20例pLGG新鲜组织离体药物敏感性分析中均提供了直接的患者来源证据。机制上，selinexor降低抗凋亡蛋白MCL-1，联合binimetinib时降低更明显。探索性斑马鱼实验中联合治疗在48小时内数值上减弱肿瘤生长，但差异未达统计显著，因此未确立体内疗效。作为FDA已批准且具有血脑屏障穿透性的药物，selinexor值得在BRAF^V600E突变pLGG中进一步临床前评估。在考虑临床转化前，需进行充分把握度的长期体内研究。