中国浙江主要致病真菌抗真菌耐药格局及烟曲霉唑类耐药机制：基于临床分离株的区域监测与cyp51A/转录组研究

《Fungal Biology and Biotechnology》：Antifungal resistance landscapes in major fungal pathogens in Zhejiang, China

　　

背景：由烟曲霉（Aspergillus fumigatus）及其他致病真菌引起的侵袭性真菌感染（invasive fungal infections, IFIs）构成重大全球健康威胁，抗真菌药物耐药的出现使治疗日益复杂。唑类抗真菌药（azole antifungals）是曲霉病的一线治疗，但耐药率在不同地理区域差异显著。本研究旨在表征中国东部浙江省杭州和义乌两市临床真菌分离株的抗真菌耐药格局，并阐明烟曲霉唑类耐药的分子机制。结果：研究人员分析了110株曲霉临床分离株的抗真菌药物敏感性。在烟曲霉菌株中，8.6%表现为唑类耐药，其中一半携带cyp51A基因中的串联重复突变TR³⁴/L98H。一株耐药菌株携带TR⁴⁶/Y121F/T289A突变组合。最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）检测显示，8.6%的烟曲霉菌株对两性霉素B（amphotericin B, AMB）耐药。研究人员鉴定出一株无已知耐药突变的耐药分离株，并通过全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）和转录组分析对其进行表征。发现了cyp51A中的新突变S437F和hmg1中的P298T；然而，使用CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）进行的功能验证表明，这些突变并不直接赋予耐药性。相反，转录组谱分析显示麦角固醇生物合成通路（ergosterol biosynthesis pathway）基因和外排转运体（efflux transporter）基因显著上调，提示替代耐药机制。在非烟曲霉物种中，所有黑曲霉（A. niger）分离株均对伊曲康唑（itraconazole, ITZ）和泊沙康唑（posaconazole, POS）耐药。结论：这项综合性区域监测揭示了在中国浙江省主要人类致病真菌中令人担忧的抗真菌耐药模式。经典耐药突变和新颖的转录介导耐药机制的鉴定，凸显了抗真菌耐药的复杂性和演变性。这些发现强调，持续监测计划和快速耐药检测方法对于指导临床治疗策略和改善患者结局至关重要。

侵袭性真菌感染（invasive fungal infections, IFIs）构成全球健康挑战，曲霉尤其是烟曲霉（Aspergillus fumigatus）被世界卫生组织（World Health Organization, WHO）列为关键优先病原，侵袭性曲霉病负担重且死亡率高，临床负担已扩展至慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）、重症监护及血液恶性肿瘤或肺癌患者。唑类抗真菌药（azole antifungals）作为一线治疗靶向cyp51A酶，但烟曲霉唑类耐药率在地理区域间差异明显，并与死亡率增加相关；耐药可由患者长期治疗选择压力和环境农业唑类杀菌剂暴露所致，TR³⁴/L98H和TR⁴⁶/Y121F/T289A等组合可导致泛唑类耐药。医院常规耐药检测不足，尤其对少见病原，浙江区域耐药谱和机制仍存在知识空白。为此，研究人员收集杭州和义乌两地临床曲霉分离株，开展耐药表型、分子机制及快速检测标记研究。关键方法方面，研究人员收集浙江省人民医院和浙江大学附属第四医院（杭州、义乌）110株曲霉临床分离株，样本包括支气管肺泡灌洗液、痰、血清等；采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）与内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）测序鉴定菌种，按EUCAST AFST_BP_v.10.2进行抗真菌药物敏感性试验（antifungal susceptibility testing, AFST）筛选并以Liofilchem MIC试条测定ITZ、VOR、POS、AMB的MIC；对唑类耐药烟曲霉进行cyp51A及启动子PCR/Sanger测序、Illumina WGS和变异分析及read2tree系统发育分析；以CRISPR-Cas9在CEA17 ΔakuBKU80/ΔpyrG背景构建突变株进行功能验证；对ITZ处理菌株进行RNA测序及差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分析。

结果部分：1. 临床菌株的分离与鉴定（Isolation and identification of clinical strains）：研究人员收集支气管肺泡灌洗液（65.5%）、痰（23.6%）等临床标本，经形态学、ITS测序和MALDI-TOF MS鉴定，共识别8种曲霉，烟曲霉为优势种（66.4%），其次为黄曲霉（16.4%）。2. 非烟曲霉物种的抗真菌敏感性谱（Antifungal susceptibility profiles of non-A. fumigatus species）：对40株非烟曲霉按EUCAST折点以梯度条测定MIC，黄曲霉中17%对ITZ耐药、50%对POS耐药，所有黄曲霉对VOR和AMB敏感；黑曲霉全部对ITZ和POS耐药，29%达到VOR耐药阈值，全部对AMB敏感；土曲霉全部对ITZ敏感，37.5%对POS耐药，未检出VOR耐药，全部对AMB敏感。3. 烟曲霉临床分离株的抗真菌敏感性谱（Antifungal susceptibility profiles in A. fumigatus clinical isolates）：70株烟曲霉中6株（8.6%）在AMB筛选平板生长并判定为AMB耐药，6株（8.6%）对唑类耐药；MIC试条显示83%耐药株ITZ MIC>32 μg/mL，仅2株VOR MIC>32 μg/mL，3株对VOR敏感，所有受试耐药株均对POS耐药（>0.25 μg/mL）。4. 唑类耐药烟曲霉菌株的分子特征（Molecular characterization of azole-resistant A. fumigatus strains）：PCR筛查cyp51A及启动子发现3株携带TR³⁴/L98H，其中Afu9054 X 881和Afu1358 X 581还携带S297T和F495I；Afu2094 X 912携带TR⁴⁶/Y121F/T289A；Afu9073 X 678无已知耐药突变，WGS与Af1163比对发现F46Y/M172V/E427K组合（与Af293比对未发现），该株ITZ MIC>32 μg/mL且对VOR、POS耐药；WGS系统发育显示Afu9073 X 678位于独特分支。5. Afu9073 X 678的变异分析与功能验证（Variant calling analysis of Afu9073 X 678 and functional validation）：以Af293为参考对cyp51A、cyp51B及其启动子、hmg1和hapE进行变异分析，发现cyp51A S437F和hmg1 P298T新突变；CRISPR-Cas9引入CEA17 ΔakuBKU80后突变株MIC与野生型一致，已知耐药突变G45W作为对照可改变表型，表明S437F和P298T不直接驱动耐药，研究转向转录机制。6. 耐药与敏感烟曲霉对ITZ的转录组响应（Transcriptomic response to ITZ in A. fumigatus resistant and susceptible strains）：对野生型CEA17 ΔakuBKU80、Afu9073 X 678和携带已知突变的Afu1358 X 581进行8 μg/mL ITZ处理30 min后的RNA测序，Afu9073 X 678相对两株比较出现大量DEGs；abcD转运体基因上调，麦角固醇生物合成基因erg5、erg24B、erg3和erg25显著上调，提示外排转运和麦角固醇通路增强参与耐药表型。

讨论部分总结：浙江临床烟曲霉唑类耐药率8.6%与上海报告7.1%接近，高于全国多中心2.5%和宁夏1.2%，远低于云南温室土壤约80%，显示中国地理差异；TR³⁴/L98H和TR⁴⁶/Y121F/T289A为环境获得性耐药机制并呈全球迁移；Afu9073 X 678的F46Y/M172V/E427K多见于环境样本，其ITZ MIC高于既往同突变环境株，结合转录组提示ABC转运体和麦角固醇合成基因过表达构成额外机制；8.6% AMB耐药值得警惕，AMB为唑类耐药感染的重要替代药物，MIC≥2 μg/mL与治疗失败和不良结局相关，双重耐药构成治疗挑战；非烟曲霉中黄曲霉和土曲霉对AMB全敏感与部分文献所述固有耐药不一致，黑曲霉对ITZ/POS普遍耐药符合已知固有耐药特征，黄曲霉17% ITZ和50% POS耐药需关注。研究结论翻译：这项综合性区域监测研究提供了中国浙江省主要人类致病真菌抗真菌耐药格局的关键见解。研究发现8.6%的烟曲霉临床分离株表现唑类耐药，其中一半携带环境获得的TR³⁴/L98H突变。鉴定出一株缺乏经典cyp51A突变但表现麦角固醇生物合成基因和外排转运体转录上调的耐药菌株，揭示了唑类耐药机制的复杂和演变性质。这一发现强调耐药监测不能仅依赖已知突变检测，而必须整合综合分子表征以捕获全部耐药机制。携带相同cyp51A突变的菌株可因额外转录适应而显示显著不同耐药表型，这对预测治疗结局具有重要意义。本研究为全球抗真菌耐药监测网络提供重要流行病学数据，并为浙江地区时间趋势监测建立基线。持续区域监测结合新发耐药通路的机制研究，对于制定有效策略应对抗真菌耐药威胁和改善危及生命真菌感染患者结局至关重要。