《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Antimicrobial and Anti-inflammatory Activities of Bacteriocin-like Inhibitory Substance-producing Lactiplantibacillus plantarum against Vaginitis-associated Pathogens
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阴道菌群失调（Vaginal dysbiosis）以阴道微生物群落紊乱、病原菌过度增殖及黏膜炎症为特征。本研究整合体外筛选、全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析、机器学习（machi
阴道菌群失调（Vaginal dysbiosis）以阴道微生物群落紊乱、病原菌过度增殖及黏膜炎症为特征。本研究整合体外筛选、全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析、机器学习（machine learning，ML）及小鼠细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）模型，对具有潜在益生功效的植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株进行系统表征。在88株乳杆菌科（Lactobacillaceae）分离株中，53株表现出细菌素样抑制物质（bacteriocin-like inhibitory substance，BLIS）活性，其中7株对阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）及念珠菌属（Candida spp.）具有广谱抗菌效果。研究人员基于抗菌活性、黏附能力（分别为15.0%和13.5%）及显著抗炎效应（包括白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平降低，p??0.92，并优先排序出候选肽。环（酪氨酸-脯氨酸）（Cyclo(Tyr-Pro)）在亚抑菌浓度下可抑制多种病原菌并减少生物膜形成，且不破坏细胞膜，提示其具有潜在的抗毒力作用。在小鼠BV模型中，益生菌处理较磷酸盐缓冲液（PBS）和MRS对照组显著降低阴道加德纳菌载量（分别降低51.2倍和41.6倍）。第5天时，活菌CYLB2146和CYLB2189组降至3.2倍和11.1倍，无细胞上清液（CFS）组降至3.2倍和0.7倍，第10天进一步降低，而对照组仍维持高水平（34.0倍和50.6倍）。益生菌处理还减轻了感染相关炎症（尤其TNF-α），并改善阴道组织形态学及组织学评分。综上，CYLB2146和CYLB2189表现出互补的抗菌、抗生物膜及抗炎活性，支持其作为BV管理候选益生菌的潜力。
论文解读文章
一、研究背景与意义
阴道微生态系统是维持女性生殖健康的关键动态平衡体系，通常由乳杆菌属（Lactobacillus）菌群主导，包括卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）、加氏乳杆菌（Ligilactobacillus gasseri）、惰性乳杆菌（Lactobacillus iners）和詹氏乳杆菌（Lactobacillus jensenii）等。这些菌群通过代谢产物、抗菌物质和免疫调节功能维持黏膜稳态。当这一平衡被破坏时，机会性病原菌如阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和白色念珠菌（Candida albicans）过度增殖，导致细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）和外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）等常见感染。BV影响全球高达30%的女性，虽多无症状，但可增加性传播感染风险和不良妊娠结局；VVC则影响约75%的女性一生中至少一次。
当前阴道感染治疗主要依赖抗生素和抗真菌药物，常用甲硝唑、克林霉素或唑类药物。然而，这些疗法往往无法恢复以乳杆菌为主导的稳定微生态，且存在高复发率、微生态破坏和抗菌药物耐药性出现等问题。这些局限性凸显了开发不仅能清除病原菌、还能重建微生物和免疫稳态的替代策略的迫切需求。
乳杆菌通过多种互补机制发挥阴道生态保护作用：产生有机酸（尤其乳酸）维持低pH并直接抑制病原菌；分泌过氧化氢（H2O2）、细菌素（bacteriocin）和细菌素样抑制物质（bacteriocin-like inhibitory substance，BLIS）抑制竞争微生物并干扰群体感应和生物膜形成；部分菌株产生生物表面活性剂减少病原菌黏附定植；此外还通过抑制NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等关键信号通路，降低促炎细胞因子产生并增强上皮屏障完整性。植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）因其代谢多样性和产生包括细菌素及小分子活性肽在内的多种生物活性代谢物的能力而备受关注。近年来，人工智能（AI）和计算生物学的进展使得基于序列和理化特征快速预测和优先排序抗菌肽成为可能，结合代谢组学和实验验证，为发现多功能益生菌来源分子提供了有力框架。本研究正是基于这一背景，系统整合培养筛选、全基因组测序（WGS）、代谢组学分析和机器学习引导的肽预测，以鉴定和表征具有抗菌和免疫调节潜力的生物活性代谢物，并在小鼠BV模型中评估其功能效应。
二、主要技术方法
研究人员从台湾传统市场采集49份发酵食品样本，并在成功大学医院伦理委员会批准下收集119份母乳和108份婴儿粪便样本，经MRS培养基微需氧培养分离乳杆菌。主要关键技术包括：基于16S rDNA测序和RAPD分析的菌株鉴定与克隆性评估；BLIS提取与Tris-Tricine SDS-PAGE分析；CFS和中和后CFS（NCFS）对阴道病原菌的抑制活性测定；HeLa细胞黏附实验和G. vaginalis感染HeLa细胞模型的抗炎活性评估（RT-qPCR检测IL-6、IL-8、TNF-α）；RAW264.7 NF-κB荧光素酶报告基因实验；Oxford Nanopore MinION平台的WGS、基因组组装（Flye）与注释（Prokka/RAST）、BAGEL4和antiSMASH次级代谢物基因簇预测；10-kDa超滤联合Sephadex G-25尺寸排阻色谱的活性肽组分分离；LC-MS/MS非靶向代谢物 profiling与MZmine 4数据处理及GNPS分子网络分析；基于随机森林（Random Forest）、XGBoost和多层感知机（Multi-layer Perceptron）的堆叠集成机器学习模型用于抗菌肽预测；合成二肽的最低抑菌浓度（MIC）测定；以及小鼠BV模型的体内疗效评价（G. vaginalis定量qPCR、细胞因子RT-qPCR和组织病理学检查）。
三、研究结果
乳杆菌菌株对阴道病原菌的抗菌活性
从母乳（n=25）、婴儿粪便（n=40）和发酵食品（n=23）中共分离88株乳杆菌。SDS-PAGE初筛鉴定69株产生<10 kDa肽类物质，排除16株生长不良菌株后，53株同时具备BLIS产生能力和良好生长性能的菌株进入后续分析。16S rDNA测序鉴定主要为加氏乳杆菌（n=22）、植物乳杆菌（n=9）、副干酪乳杆菌（n=9）、鼠李糖乳杆菌（n=5）和干酪乳杆菌（n=3）等。CFS和NCFS筛选后13株菌表现出广谱抗菌活性。CFS对细菌病原菌的抑制活性普遍强于NCFS，未接种MRS在pH 4.0时对三种细菌病原菌即表现出强抑制作用，说明pH依赖性因素在CFS抗菌活性中贡献显著。相比之下，CFS的抗真菌活性对酸度依赖较低，CYLB0366、CYLB2333和CYLB0110对白色念珠菌的抑制显著强于pH 4.0 MRS对照，表明存在非酸性的乳杆菌来源活性因子。蛋白酶K和胰蛋白酶处理结果呈菌株和病原菌依赖性异质性，热和过氧化氢酶处理显示对无乳链球菌的抑制活性对热和过氧化氢酶敏感因素尤为敏感。基于蛋白酶K结果排除CYLB2333、CYLB0110和CYLB0562后，其余10株进一步评估对G. vaginalis的活性，其中7株NCFS保留显著pH非依赖性抗菌活性（存活率7.7%-23.1%）。
乳杆菌菌株对HeLa细胞的黏附能力
7株对G. vaginalis具有强活性的菌株中，黏附率呈菌株依赖性差异（0.9%-15.0%）。CYLB2146（15.0%）、CYLB2249（13.5%）、CYLB0366（11.8%）、CYLB2189（11.3%）和CYLB0101（10.3%）表现出较高黏附率，而CYLB0633（0.9%）和SLC13（1.2%）较低。
乳杆菌菌株对G. vaginalis诱导反应的抗炎效应**
5株高黏附菌株均未在HeLa细胞中诱导IL-6或TNF-α表达。在G. vaginalis诱导炎症模型中，CYLB2146和CYLB2189显著抑制IL-6（2.3倍和3.2倍）、IL-8（2.0倍和2.4倍）和TNF-α（3.0倍和4.0倍）表达。两株菌还抑制了G. vaginalis诱导的NF-κB激活。基于此，选择分离自粪便的CYLB2146和分离自母乳的CYLB2189进行深入研究。
候选菌株CYLB2146和CYLB2189的表征
两株菌对环丙沙星、庆大霉素、甲硝唑和多黏菌素B耐药，但对替加环素、四环素、头孢他啶、阿莫西林-克拉维酸和阿奇霉素敏感。WGS显示CYLB2146含3.24 Mb环状染色体和两个质粒（48.7和71.8 kb），CYLB2189含3.10 Mb染色体和九个质粒（7.2-49.8 kb）。RAST注释未发现毒素、超抗原或毒力因子基因，ResFinder未检出获得性耐药基因，提示耐药性可能为固有性质。两株菌在MOI 100时维持>79% HeLa细胞活力，蜡螟幼虫模型中7天存活率分别为90%和100%，在pH 3.0和0.3%胆盐胁迫下维持高存活率（联合条件下分别为98.6%和99.3%）。
CYLB2146和CYLB2189中BLIS生物合成基因和次级代谢物簇的遗传组织
BAGEL4鉴定两株菌均含BLIS基因簇。CYLB2146含更完整的簇，包括多个Class IIb植物乳杆菌素肽（PlnE、PlnF、PlnJ、PlnK、PlnN和PlnA）及多种修饰酶、ABC转运体和免疫蛋白；CYLB2189含较简单的簇，核心肽为PlnE和PlnF。antiSMASH分析鉴定两株菌均含非核糖体肽合成酶（NRPS）、环二肽合成酶（CDPS）通路、萜烯等次级代谢物基因簇，共享萜烯、环状内酯自诱导物、RiPP-like、萜烯前体和III型聚酮合酶（T3PKS）等保守簇。
低分子量组分的分离及抗菌活性
CFS经10-kDa超滤和Sephadex G-25色谱分离为F1-F4四个组分。F2和F3在100 μg/mL下对G. vaginalis、N. gonorrhoeae、S. agalactiae、C. albicans和C. tropicalis均具抑制活性。F3整体活性强于F2，对细菌病原菌将活菌数从约4×10? CFU/mL降至约10? CFU/mL。值得注意的是，F3回收质量仅为F2的约十分之一，提示抗菌活性集中于较小组分。
F3组分中候选抗菌化合物的鉴定与优先排序
LC-MS/MS非靶向分析揭示F3含胆汁酸、肽类、脂肪酸和酚类化合物等复杂代谢物混合物。共鉴定13个肽类相关特征，包括二肽、三肽和环肽，分子量0.19-0.52 kDa。代表性序列包括Val-Leu-Pro-Val-Pro、Arg-Arg-Gln、Val-Phe-Arg等线性肽，以及环（Tyr-Pro）、环（Phe-Pro）、环（Val-Pro）等环肽和焦谷氨酰肽。CYLB2189产生的肽类水平高于CYLB2146。环（Tyr-Pro）在F2和F3中均被检测到，其单独存在不能区分高活性F3与低活性F2。F3含四个脯氨酸环二肽注释（环（Tyr-Pro）、环（L-Val-L-Pro）、环（Leu-Pro）、环（L-Phe-D-Pro）），与antiSMASH预测的CDPS生物合成潜力一致，但均为推定注释，立体化学构型无法由LC-MS/MS单独确定。
抗菌肽的预测性能与计算机筛选
机器学习模型对13个肽进行病原菌特异性活性预测，模型性能ROC-AUC>0.92。基于预测结果和实验验证，环（Tyr-Pro）在亚抑菌浓度下抑制多种病原菌并减少生物膜形成，且不破坏细胞膜完整性，支持其潜在抗毒力作用。
小鼠BV模型中的体内疗效
在G. vaginalis诱导的小鼠BV模型中，益生菌处理较PBS和MRS对照显著降低G. vaginalis载量（51.2倍和41.6倍）。第5天时，活菌CYLB2146和CYLB2189组降至3.2倍和11.1倍，CFS组降至3.2倍和0.7倍；第10天进一步降低，而对照组仍维持高水平（34.0倍和50.6倍）。益生菌处理还减轻了感染相关炎症（尤其TNF-α），并改善阴道组织形态学和组织学评分。
四、讨论与结论
本研究通过整合体外筛选、基因组分析、代谢组学、机器学习和体内模型，系统表征了两株植物乳杆菌CYLB2146和CYLB2189的多重益生功能。两株菌表现出互补的抗菌、抗生物膜和抗炎活性：基因组层面含多种细菌素和次级代谢物生物合成基因簇，代谢组层面鉴定出以低分子量环肽为主的多样肽类化合物，功能层面兼具广谱抗菌、抗炎和体内减菌效果。机器学习模型有效辅助了候选肽的优先排序，环（Tyr-Pro）的亚抑菌浓度抗生物膜活性提示其可能通过抗毒力机制而非直接杀菌发挥作用，这为降低耐药选择压力提供了新思路。研究结论支持CYLB2146和CYLB2189作为BV管理候选益生菌的潜力，为开发基于益生菌的阴道炎治疗策略提供了科学依据。
