《Archives of Toxicology》：Benzo[a]pyrene vs. Tapinarof: unraveling ligand-specific AHR transcriptional responses in immortalized keratinocytes
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芳香烃受体（AHR, aryl hydrocarbon receptor）整合结构多样的配体，以调控外源物代谢、免疫应答和细胞命运决定。配体特异性AHR效应在人皮肤中日益被认识，但其潜在机制仍不完全清楚。研究人员比较了永生化人角质形成细胞对环境AHR配体苯并[
芳香烃受体（AHR, aryl hydrocarbon receptor）整合结构多样的配体，以调控外源物代谢、免疫应答和细胞命运决定。配体特异性AHR效应在人皮肤中日益被认识，但其潜在机制仍不完全清楚。研究人员比较了永生化人角质形成细胞对环境AHR配体苯并[a]芘（BaP, benzo[a]pyrene）和治疗性AHR激动剂Tapinarof的转录组反应。利用AHR功能正常和AHR突变的HaCaT角质形成细胞，研究人员进行了bulk RNA测序（bulk RNA-seq）、通路富集分析（pathway enrichment analysis），以及qPCR（quantitative real-time PCR）和免疫印迹分析（immunoblot）的靶向验证。两种配体均引发主要依赖AHR但彼此不同的基因表达程序。正如预期，两种配体均增加经典AHR/ARNT（AHR nuclear translocator）通路靶基因的表达，包括细胞色素P450（CYP, cytochrome P450）1A1、CYP1B1和artemin。然而，BaP独特激活涉及表皮生长因子受体（EGFR, epidermal growth factor receptor）及下游刺激核因子E2相关因子2（NRF2, nuclear factor erythroid 2-related factor 2）转录活性的非经典AHR信号通路。Tapinarof虽启动相似初始事件（如c-Src磷酸化），但通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K, phosphoinositide 3-kinase）/蛋白激酶B（AKT）信号干扰该通路。另一组与抗病毒反应相关的基因也仅受BaP调控，并对CYP1A抑制敏感。该基因集也对依托泊苷（etoposide）有反应，后者不依赖AHR诱导DNA双链断裂（DSB, DNA double-strand break）。确实，抑制CYP1A催化的BaP代谢活化降低了磷酸化组蛋白H2AX（DNA双链断裂标志物）水平和相应基因表达。总之，研究数据表明，BaP和Tapinarof在永生化角质形成细胞中参与重叠但机制不同的AHR依赖网络，其中BaP独特结合非经典AHR–EGFR–NRF2信号和CYP1A1依赖的遗传毒性应激反应。研究结果进一步提示Tapinarof的脱靶效应（off-target effect），即AKT抑制。
该研究发表于《Archives of Toxicology》，围绕环境污染物苯并[a]芘（BaP, benzo[a]pyrene）与治疗性AHR激动剂Tapinarof在永生化人角质形成细胞中诱导的配体特异性芳香烃受体（AHR, aryl hydrocarbon receptor）转录反应展开。AHR是配体依赖转录因子，可整合外源性和内源性配体信号，调控外源物代谢、免疫应答以及增殖、分化、凋亡等细胞命运决定。在皮肤中，AHR在角质形成细胞和免疫细胞中丰富表达，参与角质形成细胞分化、表皮屏障形成及特定免疫细胞亚群发育和功能，并响应紫外辐射，表现出促稳态与促肿瘤等“双面”作用。AHR在特应性皮炎（AD）等皮肤疾病中尤为复杂：燃烧来源的游离及颗粒物结合型多环芳烃（PAH），如BaP，与AD风险增加相关；而富含AHR激活型PAH的煤焦油制剂长期用于AD等慢性炎症性皮肤病并改善屏障和炎症。Tapinarof作为细菌来源的二苯乙烯衍生物，已获美国食品药品监督管理局批准用于斑块状银屑病和AD局部治疗。尽管配体特异性AHR效应日益被认识，但其在永生化角质形成细胞中的转录程序差异、非经典信号通路及CYP1A1代谢活化相关遗传毒性机制仍不清楚，因此研究人员比较BaP与Tapinarof在AHR功能正常和AHR突变HaCaT细胞中的反应，并解析配体特异性基因表达背后的分子机制。
关键技术方法概括（≤250字）：研究使用HaCaT野生型、AHR突变（AHR-mut., DU26）和NRF2突变（NRF2-mut., DU34）角质形成细胞；以2.5 μM BaP或1 μM Tapinarof处理24 h后进行bulk RNA测序（bulk RNA-seq）及GO/KEGG通路富集分析；以qPCR（quantitative real-time PCR）和免疫印迹（immunoblot）进行靶向验证；并结合AHR拮抗剂BAY 2,416,964、CYP1A抑制剂7-羟基黄酮（7-HF）、CYP1B1抑制剂TMS、EGFR抑制剂PD153035、PI3K抑制剂Wortmannin、依托泊苷（etoposide）和EGF等药理学干预。该研究不涉及临床样本队列，所用AHR突变和NRF2突变HaCaT细胞为此前已建立并表征的细胞模型。
研究结果包括三个小标题。（1）Comparison of BaP- and Tapinarof-induced gene expression profiles in HaCaT keratinocytes（BaP与Tapinarof诱导的HaCaT角质形成细胞基因表达谱比较）。通过bulk RNA-seq发现，BaP和Tapinarof分别引起2,948和2,363个差异表达基因（DEG），共同调控1,115个基因；BaP引起的基因表达抑制更明显（约68%），Tapinarof约40%。两者均诱导经典AHR/ARNT靶基因如ALDH3A1、CYP1A1、CYP1B1和TIPARP，但BaP独特或更强诱导AKR1C亚型、CYP4F11、IFIT2和IFIT3等，Tapinarof则更强诱导SLC3A2、SLC7A5、SERPINB2和LAMA4等。qPCR验证并扩展至BkF、BNF、TCDD和PCB126等AHR激动剂，显示PAH和BNF而非Tapinarof、TCDD或PCB126诱导AKR1C3、AKR1B10、CYP4F11和PTGR1，IFIT2、IFIT3、CH25H和GJB2仅对BaP上调，支持配体特异性转录程序。
（2）BaP induces a non-canonical AHR-EGFR transcriptional response（BaP诱导非经典AHR-EGFR转录反应）。通过免疫印迹和qPCR发现，BaP与Tapinarof均可在5 min内诱导c-Src酪氨酸416位点磷酸化；EGF可刺激EGFR、ERK1/2和AKT磷酸化，BaP不抑制反而略增强EGF诱导的EGFR、ERK1/2和AKT磷酸化，Tapinarof不影响EGFR和ERK1/2却使EGF诱导的AKT磷酸化降低约50%。PD153035、Wortmannin及Tapinarof均减弱BaP诱导的AKR1C3、AKR1B10、PTGR1和CYP4F11上调，提示Tapinarof通过脱靶抑制PI3K-AKT破坏非经典AHR-EGFR-NRF2信号轴，从而区别于BaP。
（3）CYP1A enzyme activity shapes the transcriptional response to BaP（CYP1A酶活性塑造BaP转录反应）。通过AHR拮抗剂、CYP1A/CYP1B1抑制剂及etoposide处理并结合qPCR和免疫印迹发现，BaP诱导IFIT2、IFIT3、IL-6和OASL等抗病毒反应基因，BAY 2,416,964降低其诱导，CYP1A抑制剂7-HF降低抗病毒基因表达但不影响CYP1A1和AKR1C3上调，CYP1B1抑制剂TMS不影响该抗病毒基因集。BaP和etoposide增加γH2AX（DNA双链断裂标志物），Tapinarof不增加；BAY或7-HF显著减少BaP诱导的γH2AX。由于CYP1A2在人角质形成细胞中不表达或仅轻微表达，结果支持CYP1A1催化BaP代谢活化及DNA损伤塑造BaP特异性AHR依赖转录反应。
讨论部分总结：研究揭示基础AHR活性可调控数百个基因，可能反映培养环境中内源性配体激活，但AHR抑制基因表达的机制未在本研究中解析。BaP和Tapinarof均启动c-Src相关早期事件，但BaP经c-Src/EGFR及下游PI3K-AKT促进NRF2活性，诱导AKR1C3、CYP4F11和PTGR1等；Tapinarof虽不抑制EGFR和ERK1/2，却抑制EGF诱导的AKT磷酸化，提示PI3K/AKT抑制为其潜在脱靶效应。BaP经CYP1A1代谢活化形成BPDE等加合物，复制叉停滞后可导致DSB，并触发AHR依赖的抗病毒I型干扰素相关基因反应；该反应在急性期可能具细胞内在保护性，慢性暴露下可能变为适应不良。BkF未诱导该反应可能与其遗传毒性较低有关。Tapinarof特异性上调SLC7A5/LAT1可能影响L-色氨酸和犬尿氨酸摄取，从而调节AHR活性。讨论还比较了空气颗粒物PAH与药用煤焦油的差异，认为PAH组成、小环PAH对CYP1催化活性的抑制、皮肤微环境及暴露剂量和时程可部分解释二者在AD风险与治疗上的差异。研究局限在于使用增殖状态下的永生化角质形成细胞系，尚需在原代分化角质形成细胞或3D重建人表皮模型中验证。
研究结论（译）：总之，研究数据表明，环境污染物BaP和治疗药物Tapinarof引发主要依赖AHR但彼此不同的转录组反应，尤其体现在各配体调控基因的范围上。其中部分差异源于经EGFR及下游通路的非经典AHR信号，以及CYP1A1和DNA损伤依赖的转录反应。研究数据还提示，AHR激动剂Tapinarof抑制AKT信号，这可能是该药物的潜在脱靶效应，尚需进一步实验验证。研究人员预期，该研究结果有助于加深对AHR信号配体特异性差异的理解，并促进该方向研究，最终更好地利用AHR配体用于疾病预防和治疗。
