灵敏环保型双波长同步荧光光谱法同时定量药物与生物基质中的盐酸度洛西汀和1-萘酚

《Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences》：Simultaneous quantification of duloxetine and 1-naphthol in pharmaceutical and biological matrices using a sensitive and eco-friendly synchronous fluorescence technique

　　

背景：盐酸度洛西汀（DL）是一种广泛处方的5-羟色胺–去甲肾上腺素再摄取抑制剂，由于可能存在遗传毒性工艺相关杂质1-萘酚（NP），需要严格的质量控制。DL和NP表现出几乎相同的固有荧光光谱，这对通过常规荧光法同时定量构成了重大挑战。

目的：本研究旨在开发并验证一种快速、灵敏、可持续且环境友好的同步荧光光谱（SFS）方法，在无需色谱分离或化学衍生化的条件下，同时测定药物和生物基质中的DL与NP。

方法：采用固定波长差（Δλ = 125 nm）优化了双波长SFS方法，在80%甲醇–Britton–Robinson缓冲液体系（pH 3.0）中，DL于356–362 nm、NP于359–366 nm处实现选择性检测。该方法依据ICH Q2(R1)指南进行充分验证，并使用四种互补的绿色度指标（AGREE、ComplexMoGAPI、Analytical Eco-Scale和Blue Applicability Grade Index，BAGI）对其可持续性进行了严格评估。

结果：两种分析物在20–500 ng/mL范围内获得线性校准曲线（r² ≥ 0.9996）。检出限分别为DL 6.19 ng/mL、NP 6.54 ng/mL；日内及日间精密度（%RSD < 1.5%）；平均回收率分别为DL 100.26%、NP 99.89%。该方法在Cymbalta?胶囊和加标人血浆中表现出优异的特异性。综合绿色度评估证实了其高可持续性：AGREE得分0.79，ComplexMoGAPI得分72.5/100，Analytical Eco-Scale得分81，BAGI得分72.5/100，总体将该方法归类为“优异绿色分析”，并具有很强的实际适用性。

结论：所提出的SFS方法代表了一个免色谱、免衍生化且经过验证的平台，具有增强的可持续性特征，成功平衡了分析性能、环境责任和实验室可行性。它为DL及其遗传毒性杂质NP的常规质量控制和生物分析监测提供了一种可持续、经济高效且符合监管要求的解决方案。

盐酸度洛西汀（Duloxetine hydrochloride, DL）是一种5-羟色胺–去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRI），临床用于重度抑郁障碍、广泛性焦虑障碍、糖尿病周围神经病变、纤维肌痛及慢性肌肉骨骼疼痛等。其合成与储存过程中可能产生结构相关的遗传毒性杂质1-萘酚（1-naphthol, NP）。依据ICH M7指南，遗传毒性杂质的毒理学关注阈值（TTC）为1.5 μg/天；按DL最大日剂量60–120 mg计算，NP的可接受限量约为12.5–25 ppm，需要高灵敏分析手段进行监测。然而，DL与NP均以萘环为共轭母核，两者固有荧光光谱几乎完全重叠，常规荧光法难以同时定量。传统HPLC-UV法虽应用广泛，但消耗大量有机溶剂、能量需求高，且对痕量遗传毒性杂质的灵敏度常不足；部分分光光度法选择性差；衍生化法则增加操作复杂度和试剂消耗。在此背景下，亟需开发一种免色谱、免衍生化、兼具高灵敏度和绿色环保特性的方法，用于药物和生物基质中DL与NP的同时测定。

研究人员基于同步荧光光谱（SFS）原理，固定波长差Δλ = 125 nm，在pH 3.0的80%甲醇–Britton–Robinson缓冲液体系中，分别于356–362 nm（DL）和359–366 nm（NP）处获取选择性信号，无需色谱分离或化学衍生化。方法依据ICH Q2(R1)指南完成验证，并以AGREE、ComplexMoGAPI、Analytical Eco-Scale和Blue Applicability Grade Index（BAGI）四种工具评估绿色度与实际适用性，同时将方法应用于Cymbalta?胶囊和加标人血浆。

关键技术与方法包括：①同步荧光扫描，固定Δλ同时扫描激发与发射单色器，收窄发射谱带并降低瑞利和拉曼散射干扰；②双波长检测，利用pH 3.0质子化环境下DL与NP斯托克斯位移的细微差异，在各自波长区间定量；③参数优化，系统考察Δλ（50–200 nm）、稀释溶剂种类、缓冲液体积及pH对荧光强度的影响；④ICH Q2(R1)方法验证，涵盖特异性、线性、准确度、精密度、LOD/LOQ及稳健性；⑤绿色度多指标评价，包括AGREE、ComplexMoGAPI、Analytical Eco-Scale和BAGI；⑥生物样品前处理，人血浆经乙腈沉淀蛋白、离心、蒸发、复溶后直接分析。样本来源：DL标准品（纯度99.30%）由EVA Pharma（开罗，埃及）提供，NP标准品（纯度99.15%）由Atco Pharma（梅努菲亚，埃及）提供；Cymbalta?胶囊由Lilly de Caribe Inc.（波多黎各）生产，批号D801442。

光谱特征与重叠荧光谱：DL与NP共享萘环π共轭体系，激发最大约236 nm，发射最大分别为DL 358 nm和NP 354 nm；两者氧原子均与萘环直接相连，电子效应相似，因而常规荧光光谱严重重叠。一阶和二阶导数变换无法有效分离且增加噪声；而SFS在Δλ = 125 nm下显著窄化谱带，配合双波长读取，成功解决了重叠光谱的定量难题。

方法验证：校准曲线在20–500 ng/mL范围内线性良好（r² ≥ 0.9996）；LOD分别为DL 6.19 ng/mL、NP 6.54 ng/mL；日内精密度（%RSD）为DL 1.244%、NP 1.175%，日间精密度为DL 1.329%、NP 0.991%；平均回收率DL为100.26%、NP为99.89%；在药物制剂中的标准加入回收率为98.5%–101.3%；稳健性考察中，Δλ、pH和缓冲液体积的微小变动均使%RSD < 2%，符合ICH Q2(R1)要求。

药物制剂应用：对Cymbalta?胶囊（标示量60 mg DL）的测定结果为标示量的98.7%–101.1%，表明该方法适用于常规制剂质量控制。

生物基质应用：加标人血浆中DL和NP的回收率为97.8%–102.1%，%RSD < 2.0%；方法LOD（低于7 ng/mL）低于DL治疗血浆峰浓度C_max（47–110 ng/mL），可用于药代动力学和生物利用度研究。

综合绿色度评估：AGREE得分0.79、ComplexMoGAPI得分72.5/100、Analytical Eco-Scale得分81、BAGI得分72.5/100，四项指标共同将方法归类为“优异绿色分析”，并确认其具备较强的实际应用可行性。

讨论指出，该方法的创新核心在于选择Δλ = 125 nm，并结合pH 3.0的质子化环境，将DL中–O–CH?–基团与NP中–OH基团在给电子能力上的细微差异放大为可检测的斯托克斯位移差，从而实现免色谱分离下的双波长同时定量；这一分辨率是一阶或二阶导数荧光法无法实现的。与文献报道的方法相比，该法的LOD比HPLC-UV、CMEEK和分光光度法低约30–100倍，且可扩展至生物基质，无需复杂萃取程序。常规分析流程仅需约8 mL 80%甲醇，无需使用乙腈作为流动相，常温常压操作，与常规HPLC相比有机溶剂消耗减少超过80%，能耗减少超过95%，在分析性能与环境责任之间取得了良好平衡。局限性方面，研究未进行强制降解试验；生物应用仅在加标人血浆中验证，尚需使用真实临床样本加以进一步确认；未来可探索更环保的生物基溶剂以进一步提升环境友好性。研究结论为：本研究成功开发并验证了一种免色谱、免衍生化的双波长SFS方法，可在单次分析中同时定量DL及其遗传毒性杂质NP；方法符合ICH Q2(R1)指南要求，多指标绿色度评价证实其可持续性与实用性，为药物常规质量控制与生物分析监测提供了一个兼顾科学严谨性和环境责任的分析平台。