《Cancer and Metastasis Reviews》：Inferring tissue origin from cell-free DNA in metastatic cancer
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转移性癌症管理中的一个重大临床挑战，不仅是确定肿瘤来源的循环游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）的存在，还包括通过循环cfDNA信号所反映的组织谱系和器官背景。CfDNA通过保留其起源组织特有的分子特征来支持此类推断，这些特征包括DNA甲基化
转移性癌症管理中的一个重大临床挑战，不仅是确定肿瘤来源的循环游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）的存在，还包括通过循环cfDNA信号所反映的组织谱系和器官背景。CfDNA通过保留其起源组织特有的分子特征来支持此类推断，这些特征包括DNA甲基化、5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine, 5hmC）、片段组学（fragmentomic）谱、核小体定位模式以及组蛋白修饰。本综述考察了基于cfDNA的组织起源确定所依据的生物学原理、用于解读这些信号的计算框架，以及临床转化的关键障碍。研究人员还比较了具有代表性的反卷积和分类策略，包括线性和概率模型、机器/深度学习，以及基于单细胞信息的参考方法。尽管已取得重大进展，临床整合仍受到低肿瘤分数、多组织异质性贡献、非恶性细胞死亡产生的背景噪声，以及缺乏稳健的前瞻性验证等因素的阻碍。研究人员进一步强调，转移性血浆中的来源估计应在混合组织贡献、差异性释放（differential shedding）、参考设计及模型不确定性的背景下进行解读，而非将其视为解剖学转移负荷的直接度量。
论文主体内容总结
1 背景
在转移性癌症中，一个核心临床挑战不仅是确定肿瘤来源cfDNA的存在，还要确定其信号所源自的具体组织谱系。这一区分对于原发灶不明的癌症患者、多发性肿瘤病灶患者尤为关键，因为治疗决策依赖于组织起源的准确识别，而非仅仅检测到肿瘤。尽管影像学和组织活检仍是基础诊断工具，但二者在精确来源推断方面往往不足。影像学主要提供解剖学或代谢定位，而活检局限于所取样的病灶，可能无法捕捉转移性疾病的完整异质性。
CfDNA因其保留了来源组织的表观遗传和结构特征，包括DNA甲基化模式、片段组学谱和核小体相关信号，为组织起源推断提供了重要价值。然而，血液中的cfDNA并非组织起源的直接或明确指示物，而是来源于多种来源的异质性混合物，如造血前体细胞、原发性和转移性肿瘤组织，以及经历细胞更新或损伤的正常组织。因此，从cfDNA推断组织起源需要解码一个复杂、动态的混合物，而非仅仅检测肿瘤来源的遗传物质。
这些挑战在转移性癌症背景下更为突出，源于多个来源同时释放cfDNA，不同器官的贡献比例各异。此外，非恶性过程（如组织损伤和系统性炎症）释放的cfDNA进一步干扰分析。转移性病灶特异贡献的cfDNA肿瘤分数可能极低，尤其是在转移负荷有限的患者中。这些因素共同使组织起源推断区别于其他cfDNA应用，包括治疗监测、克隆演化分析和微小残留病灶检测。
本综述聚焦于转移性癌症中基于cfDNA的组织起源推断，区别于一般癌症筛查或纵向监测等更广泛的cfDNA应用。综述着重探讨一个更具体的问题：在转移性疾病中应如何解读计算来源估计？转移性癌症中的组织起源推断不应简单视为常规的单来源组织分类问题，因为血浆可能同时包含来自多个恶性病灶和非恶性组织的cfDNA贡献。综述首先考察来源推断的生物学基础，随后讨论主要的cfDNA信号类别及其分析计算框架，包括反卷积、机器/深度学习和基于单细胞信息的参考策略。在此框架内，综述区分了分类（将样本分配到候选组织类别）与反卷积（估计多个组织或细胞类型的分数贡献），并区分肿瘤谱系信号、宿主器官信号和病灶水平解剖定位。综述评估了这些方法可能获益的临床情境，并阐述了当前限制临床实施的转化障碍。
2 为什么传统方法不足以在转移性疾病中进行来源归因
虽然传统诊断检测在转移性癌症管理中不可或缺，但它们在准确推断组织起源方面存在不足。在许多临床场景中，关键问题不仅限于转移的存在，还在于识别多个病灶或循环中检测到的肿瘤来源信号的主要贡献组织。
CT、MRI和PET-CT等影像学模态提供了解剖学和功能信息，包括病灶位置、大小和代谢活性。然而，它们无法直接确定哪个组织贡献了观察到的血浆信号。此外，在病灶微小、隐匿或经治疗改变的患者中，影像学效能可能受限。
组织活检仍是诊断金标准，能够实现所取样病灶的组织病理学确认和分子表征。然而，活检仅捕获单一部位的信息，可能无法代表疾病的全身性全貌。此外，重复活检具有侵入性，在纵向评估中往往不切实际。
循环肿瘤细胞和细胞外囊泡作为液体活检的一部分，携带可提供转移进展洞察的分子信号。然而，它们在组织起源推断中的常规临床应用受到技术变异性、缺乏标准化和可扩展性有限的阻碍。
相比之下，cfDNA比位点受限的组织取样或区室特异性活检提供了更全面的全身性视图。它可以无创地随时间采样，并反映不同组织的多个病灶。然而，cfDNA不提供组织起源的直接读数；相反，它包含来自造血细胞、健康组织、原发肿瘤和转移性病灶的DNA复杂混合物。因此，核心挑战不仅是检测肿瘤来源的DNA，而是从一个生物学异质且动态的循环DNA池中推断其组织起源。传统方法在此情境下的主要局限性在于它们不能充分解决组织起源归因这一更广泛的问题。
3 cfDNA来源推断的生物学决定因素
3.1 使cfDNA组织起源推断成为可能的生物学基础
CfDNA促进组织起源推断，因为循环片段保留了由其来源细胞的染色质状态、核酸酶活性和表观遗传景观塑造的特征。这些特征包括DNA甲基化模式、片段大小分布、末端基序和核小体相关信号，共同保留了关于谱系身份和组织背景的信息。因此，cfDNA分析既能检测肿瘤来源物质，也能识别贡献于循环DNA池的组织。
然而，cfDNA的组织起源并非直接可观察，必须从与其来源相关的分子特征中推断。在血浆中，起源信号必须从由不同细胞群体释放的、通常低丰度的片段混合物中推断。因此，主要分析挑战不在于cfDNA本身的检测，而在于从高度异质性的生物学背景中反卷积组织特异性信号。
3.2 用于来源推断的信号类别
没有任何单一的cfDNA特征足以在多样化的临床和生物学环境中支持完全可靠的组织推断，因为不同的信号类别捕获组织身份的不同方面，而每种信号都可能受到肿瘤特征、生物学变量和临床因素的干扰。因此，cfDNA信号通常根据其传递的组织水平信息和可能模糊其解读的潜在歧义进行最佳分类。总体而言，关键信号类型对组织归因具有不同的效用：DNA甲基化是最具生物学直接性的谱系分配标志物之一；5hmC和组蛋白修饰提供互补的表观遗传信息；片段组学和相关染色质信号作为辅助工具。在转移性疾病中，背景干扰和可变的生物学因素可能使结果产生偏差，单一信号往往无法实现精确的组织起源映射。
4 cfDNA信号与组织起源推断的方法-任务映射
血浆cfDNA由来自造血细胞、原发肿瘤、转移性病灶和非恶性组织的DNA片段组成，使组织起源推断具有内在复杂性。有效的推断因此取决于理解哪些cfDNA信号保留组织特异性信息，以及选择适当利用这些信号的计算方法。
4.1 DNA甲基化
DNA甲基化谱包含强烈的组织和谱系相关模式，使其对将cfDNA分配到组织类别具有信息价值。它们尤其用于原发灶不明癌症，其中区分谱系可直接指导诊断。然而，可达到的分辨率在很大程度上取决于参考图谱的粒度和完整性。传统的批量组织参考可能模糊共享免疫、基质或内皮成分的组织，从而降低器官水平特异性。相比之下，包含器官特异性上皮或实质细胞群的细胞类型解析图谱可以通过分离共享细胞信号与更器官限制性特征来改善组织区分。参考完整性在细胞类型分辨率下仍然至关重要，因为遗漏或代表性不足的群体可能将推断的贡献重新分配到相关组织并降低可解释性。共享的跨器官细胞类型、恶性或转移状态的表征不完整、低肿瘤分数以及多病灶同时释放仍可限制病灶水平定位。因此，基于甲基化的组织起源推断的分辨率不仅取决于甲基化本身的信息含量，还取决于参考设计和转移性cfDNA混合物的生物学复杂性。基于甲基化的预测最好被解读为概率性的组织或细胞类型归属，而非确定性的病灶水平定位。
4.2 5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）
5hmC是5-甲基胞嘧啶的氧化衍生物，具有组织依赖性基因组分布，是来源归因的额外表观遗传信号。循环5hmC的研究已鉴定出癌症类型特异性模式，并显示出在选定肿瘤类型和疾病分期中的区分能力。这些研究支持5hmC主要用于癌症类型分类和组织起源预测。最近，基于参考的方法已开始探索通过将组织或细胞类型特异性5hmC参考谱与计算反卷积框架（如CIBERSORT）相结合来进行定量组织反卷积，提示5hmC也可能支持超越样本分类的组织贡献估计。然而，这些研究数量仍然有限，尚未在同时包含多个恶性和非恶性组织贡献的转移性血浆中得到系统验证。5hmC丰度较低，检测平台标准化程度不足，定量多来源反卷积的证据仍在涌现。因此，5hmC目前最好被视为补充性的组织相关表观遗传信号，而非用于转移性组织起源推断的成熟独立反卷积平台。
4.3 片段组学（Fragmentomics）
片段组学特征，包括cfDNA片段长度、末端基序和核小体足迹，反映了来源组织的染色质可及性和核酸酶活性。这些特征适合作为辅助信号，在低肿瘤分数或高噪声样本中加强组织推断，通常与甲基化数据互补。
