结核病（TB）诊断中的分子识别技术进展：基因组识别、蛋白质与脂质识别及功能核酸识别

《One Health Advances》：Advances in molecular recognition for tuberculosis diagnostics

　　

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）引起的最致命传染病之一。近年来，分子识别技术的进展促进了结核病诊断的创新。本综述聚焦于与结核病诊断相关的主要生物分子，包括病原体衍生生物分子（核酸、细菌细胞、蛋白质和脂质）以及宿主响应生物标志物（细胞因子）。此外，研究人员系统概述了用于检测这些生物分子的三类分子识别技术：基因组识别技术、蛋白质与脂质分子识别技术以及基于功能核酸（functional nucleic acids，FNAs）的分子识别技术。进一步地，本综述回顾了这些技术如何提高结核病诊断的敏感性、特异性和效率。最后，讨论了该领域当前的挑战和未来方向，为改进结核病早期检测、耐药监测以及优化个体化治疗策略提供见解。

引言
结核病（TB）是由结核分枝杆菌复合群（MTBC）引起的慢性传染病，仍是全球公共卫生的重要威胁。MTBC包括结核分枝杆菌（M. tuberculosis，MTB）、牛分枝杆菌（M. bovis）等，非结核分枝杆菌（NTM）感染症状可与肺结核（PTB）相似，准确鉴别具有临床意义。MTBC耐药可导致治疗失败和死亡率升高。传统诊断方法如抗酸染色、结核菌素皮肤试验、干扰素-γ释放试验（IGRA）、分枝杆菌培养、表型药物敏感性试验（pDST）和胸部X线存在敏感性、特异性、耗时或操作复杂等局限。为此，研究人员围绕病原体来源核酸、细菌细胞、蛋白质、脂质及宿主细胞因子发展了分子识别技术，并归纳为基因组识别、蛋白质与脂质分子识别和基于功能核酸（FNAs）的分子识别三类。

基因组识别技术
基因组研究为病原检测、基因分型和耐药分析提供核酸层面基础，主要包括核酸扩增技术和基因组测序技术。

核酸扩增技术
核酸扩增技术可在体外指数扩增目标序列，提高检测敏感性和特异性，常与热循环扩增或等温扩增结合用于序列识别。

热循环核酸扩增技术
聚合酶链反应（PCR）及其变体在TB诊断中应用广泛。微滴数字PCR（ddPCR）可分液滴单分子扩增，结合外泌体DNA（exoDNA）检测MTB IS6110基因；粪便定量实时PCR（qPCR）检测IS6110基因可作为痰检补充；多重PCR（mPCR）可区分MTBC与NTM。Xpert属于世界卫生组织（WHO）推荐的分子快速诊断检测（mWRDs）。该类方法敏感性高、适用广，但依赖热循环仪、荧光探针和专用设备，数字PCR流程较复杂，限制其在资源受限场景的应用。

等温核酸扩增技术
等温扩增无需昂贵热循环仪，适合即时检验（POC）。环介导等温扩增（LAMP）是TB诊断中最常用的等温方法，需4–6条引物、Bst DNA聚合酶及60–65 °C恒温条件，可与分子信标（MB）结合实现可视化检测；数字LAMP、多重LAMP结合三维纸基微流控和侧向流试纸条可检测MTBC与NTM。发夹介导扩增（HMA）可降低引物二聚体所致假阳性；重组酶聚合酶扩增（RPA）结合CRISPR/Cas12a和DNA功能化金纳米颗粒可实现双模式传感。该类方法仍面临非特异扩增、携带污染、样本到答案平台受限及临床标准化验证不足等问题。

基因组测序技术
测序技术包括文库构建、测序和数据分析，已用于TB诊断和耐药预测。与核酸扩增相比，测序可提供更全面的突变信息和全基因组分析。

下一代测序（NGS）技术
NGS包括全基因组测序（WGS）、宏基因组NGS（mNGS）和靶向NGS（tNGS）。WGS通常需培养富集DNA，可用于传播链分析、暴发溯源和耐药相关突变预测，但基因型与表型耐药关联仍需研究。mNGS无需培养，可直接检测临床样本中的微生物基因组，适用于疑似PTB鉴别及肺外TB，但易受背景噪声干扰而产生假阳性。tNGS通过靶向富集病原或耐药相关区域，成本较mNGS低，可检测更广的耐药突变，WHO已认可其用于耐药TB诊断；其常规应用受流程复杂、实验室基础设施、人员及WHO突变目录更新依赖的限制。

第三代测序技术
纳米孔测序通过单链DNA过孔引起的离子电流变化读取序列，具有建库简化、长读长、测序时间短、维护成本低和便携等优势，可在较短时间内预测MTBC对多种抗TB药物的耐药性。不同测序技术的识别广度不同：WGS为全基因组无偏识别，mNGS为复杂背景中的数据库驱动读段归类，tNGS为耐药相关区域靶向富集，纳米孔测序支持实时信号判别和快速变异分析；但端到端流程资源密集，仍需临床专业知识和专门实验室条件。

蛋白质和脂质分子识别技术
MTBC特异蛋白和脂质在致病及免疫逃逸中发挥重要作用，如6 kDa早期分泌抗原靶（ESAT-6）和10 kDa培养滤液蛋白（CFP-10）为毒力因子，脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）为具有免疫调节活性的细胞壁糖脂。识别和检测这些分子有助于TB诊断及新治疗策略研究。

噬菌体展示技术
噬菌体展示技术可将外源肽或抗体展示于噬菌体表面，通过生物淘选富集高亲和力和靶特异性的噬菌体，常用固相淘选，也可采用液相、负筛、竞争、非扩增和体内淘选，并以酶联免疫吸附试验（ELISA）、表面等离子体共振（SPR）等评价结合能力。该技术已用于筛选识别MTB Hsp16.3的T细胞受体（TCR）样抗体及抗LAM单克隆抗体，后者可用于尿LAM侧向流检测。噬菌体展示筛选抗体可能存在亲和力较低的问题，亲和成熟策略尚未用于TB诊断；模拟表位肽ELISA虽显示较高特异性与敏感性，但仍需制造标准化和大规模临床评价。

化学探针标记技术
化学探针标记技术基于生物正交化学和点击化学，通过酶介导激活、代谢标记、生物合成掺入和主动运输等机制标记蛋白质和脂质。酶介导激活探针可检测硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性；代谢标记探针可经海藻糖通路标记活菌；生物合成掺入策略可标记含甘露糖糖脂如LAM；基于铁转运和铁螯合开关的探针可标记BCG和MTB H37Rv。该类探针有助于解析分枝杆菌蛋白和脂质功能及宿主互作，但临床分离株差异和荧光成像硬件需求限制其转化。

基于抗体的分子识别技术
抗体识别技术针对ESAT-6、CFP-10、MPT64、Ag85B、LAM和干扰素-γ（IFN-γ）等抗原。IGRA可检测MTB特异抗原刺激后T淋巴细胞释放IFN-γ，用于潜伏性结核感染（LTBI）诊断，但操作复杂、耗时且敏感性有限。免疫层析法和免疫传感器因性能优势受到关注。

免疫层析法
免疫层析法以硝酸纤维素膜为抗原抗体反应介质，通过金纳米颗粒等信号变化检测目标。含负电荷氮空位（NV^?）中心的荧光纳米金刚石（FND）可用于自旋增强磁光免疫层析检测ESAT-6，并区分MTBC与NTM；DPP VetTB可检测动物血清中MPB83和ESAT-6/CFP-10融合蛋白抗体。尿LAM检测方面，AlereLAM为快速诊断工具，FujiLAM采用多克隆抗LAM表位抗体和银放大步骤，提高了检测性能。

光学免疫传感器
光学免疫传感器通过光吸收、荧光、反射、折射率和拉曼散射等变化检测抗原抗体相互作用，包括SPR、表面增强拉曼散射（SERS）和电化学发光（ECL）免疫传感器等。ECL免疫传感器可利用不同抗体检测非痰样本中的MTB LAM并评估诊断准确性。

电化学免疫传感器
电化学免疫传感器将抗原抗体结合转化为电信号，可分为安培、伏安和阻抗型。抗污染策略可减少器件污染、电极钝化和特异性丧失。基于半导体单壁碳纳米管场效应晶体管（SWCNT FET）的传感器可检测Ag85B；纸基电化学免疫传感器固定抗Hsp16.3抗体，并以[Fe(CN)₆]^3?/4?为氧化还原指示剂监测电子转移。该类传感器灵敏度较高，但抗体制备筛选耗时且批间亲和力、特异性和稳定性差异影响重现性。

基于功能核酸（FNAs）的分子识别技术
FNAs包括适配体、功能核酶、G-四链体（G4）、核糖开关、发光核酸、修饰核酸和核酸纳米材料等，具有可编程性和分子识别特性。目前用于TB诊断的主要有适配体、核酶和G4，常与生物传感器结合。

基于适配体的分子识别技术
适配体由体外筛选获得，可经靶分子诱导构象折叠实现高亲和、高特异识别，常通过指数富集配体系统进化（SELEX）从单链DNA或RNA文库中筛选，具有易合成修饰、批间一致和靶标适用广等优点，被称为化学抗体。基于信号识别、转导和输出机制，可分为侧向流、光学和电化学传感器。

基于适配体的侧向流传感器
为克服抗体稳定性和成本限制，适配体被用作靶识别元件。利用原核表达的噬菌体尾蛋白作为捕获剂、荧光微球标记适配体作为信号示踪物，可构建检测MTB和耻垢分枝杆菌的侧向流传感器，并在盐水、尿液和唾液等基质中实现稳定检测。

基于适配体的光学传感器
适配体光学传感器包括荧光、比色、SERS和SPR等，其中荧光传感器应用较多。适配体可与热循环或等温核酸扩增结合增强信号。基于适配体的qPCR（Apta-qPCR）通过分子信标与适配体杂交检测ESAT-6，并已在临床血清样本中评估。基于焦磷酸-铈配位聚合物纳米颗粒（PPi-Ce CPNs）的荧光传感器可检测IFN-γ；基于双荧光和二元可视化的催化发夹组装（CHA）传感器及双荧光双靶标（IFN-γ和IFN-γ诱导蛋白10，IP-10）传感器可提高灵敏度并缩短刺激时间。此类传感器在血样中与临床诊断结果一致。

基于适配体的电化学传感器
适配体电化学传感器以电极表面固定的适配体为识别元件，靶结合引起的构象变化转化为电信号，可定量分析。基于MXene@hemin-Au和氮掺杂碳纳米管（N-CNTs）等纳米材料的传感器可检测ESAT-6；基于C₆₀NPs和Au@Pt的双底物催化传感器、基于Ti₃C₂T_x的无底物催化传感器均实现了高灵敏检测。适配体亲和力受结合缓冲液（如金属离子）和实验条件影响，真实样本中需严格控制条件并减少基质效应，可在复杂样本基质条件下筛选适配体以改善性能。

基于其他功能核酸的新型分子识别技术
基于DNAzyme的新型分子识别技术
脱氧核酶（DNAzyme）为具有酶催化性质的DNA寡核苷酸，可催化DNA/RNA切割、连接、模拟过氧化物酶活性等。RNA切割型10–23 DNAzyme由环状催化域和两侧底物结合臂组成。将核酸序列依赖性扩增与分裂DNAzyme级联结合可比色检测MTBC 16S rRNA、rpoB、katG和gyrA序列点突变；多重PCR结合分裂DNAzyme荧光传感器可检测23S rRNA、inhA、rpoB、katG和gyrA突变；不对称PCR结合分裂DNAzyme可检测MTBC并区分NTM。

基于G-四链体（G4）的新型分子识别技术
G4由富鸟嘌呤核酸序列通过Hoogsteen氢键折叠形成，G4与血红素形成的G4-heme DNAzyme具有模拟过氧化物酶活性。巢式PCR结合分裂G4探针可协同识别目标并形成完整G4结构，进而催化H₂O₂介导的ABTS^2?氧化，用于快速检测rpoB耐药突变。

结论与展望
分子识别策略在提高TB诊断敏感性、特异性和效率方面取得进展，但不同方法在样本类型、靶病原范围、毒力因子识别、抗TB药物覆盖和耐药基因靶向能力方面存在差异，且不同国家、地区和人群的临床应用标准尚未统一。未来应关注非侵入样本诊断的参考标准标准化和大样本验证；在One Health框架下重视野生动物TB，开发适合野生动物的MTBC检测体系；优化FNAs分子识别元件，改善生物基质中的稳定性、长期保存和质控，并探索核糖开关等新型识别元件及商业化转化。