泛非天然产物库化合物齐墩果酸、Poinsettifolin B与Rhuschalcone III破坏SARS-CoV-2刺突蛋白-宿主ACE2相互作用并抑制SARS-CoV-2复制

《BMC Pharmacology and Toxicology》：The pan-African natural products library compounds oleanolic acid, poinsettifolin B, and rhuschalcone III disrupt SARS-CoV-2 spike-host ACE2 interactions and SARS-CoV-2 replication

　　

摘要专业翻译 基于天然产物（NP）的化合物库是抗病毒化合物的丰富来源，可作为治疗病毒性疾病的新型先导化合物的基础，尤其是对于无法持续获得现有疫苗和治疗药物的群体。为鉴定新的基于NP的SARS-CoV-2细胞进入和病毒复制的候选抑制剂，研究人员筛选了泛非天然产物库（p-ANAPL），这是一个从非洲药用植物中获得的物理纯化合物集合，筛选能够破坏SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）与其宿主ACE2进入受体之间体外相互作用的NPs。该筛选鉴定出三种化合物——齐墩果酸（oleanolic acid）、poinsettifolin B和rhuschalcone III——它们以0.5–2.4 μM的半最大抑制浓度（IC50）破坏RBD/ACE2相互作用，但不破坏无关的PD-1/PD-L1宿主配体/受体结合对。齐墩果酸和rhuschalcone III（而非poinsettifolin B）还在低微摩尔浓度下于Vero细胞中抑制SARS-CoV-2复制，且无细胞毒性。计算建模表明，所有三种化合物与众多RBD和ACE2残基相互作用，包括在SARS-CoV-2关切变异株中保守的残基子集。综上，研究人员鉴定出三种选择性干扰SARS-CoV-2进入和/或病毒复制相关因素的NPs，代表了在资源有限地区管理COVID-19的新型抗病毒先导化合物。

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一、研究背景与意义

尽管SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2型，COVID-19的病原体）在世界大部分地区已得到日益有效的管控，但在许多中低收入国家（LMICs），SARS-CoV-2疫苗和治疗药物的获取仍然有限或不稳定。由于无法获得西方药物，许多LMICs居民依赖当地药用植物作为初级卫生保健手段。因此，从药用植物中鉴定能够抑制SARS-CoV-2复制的天然产物（NPs），对于在缺乏西方疫苗和治疗药物的情况下开发本地可及的COVID-19管理方案具有重要意义。

泛非天然产物库（p-ANAPL）是可供筛选的最大规模的非洲药用植物来源NP实体化合物库之一。该库此前已成功用于鉴定HIV和甲型流感病毒复制的新型抑制剂以及去乙酰化酶活性抑制剂。鉴于这些研究均证明了从p-ANAPL获得新型筛选命中物的能力，研究人员假设p-ANAPL中也可能含有作用于SARS-CoV-2复制的NPs。

SARS-CoV-2进入细胞主要依赖于病毒刺突蛋白的受体结合域（RBD）与宿主ACE2受体的结合。这一相互作用促进宿主蛋白酶对刺突蛋白的蛋白水解激活，进而启动膜融合和病毒进入。研究团队及他人已鉴定出大量选择性干扰RBD/ACE2相互作用和/或在活病毒或假病毒实验中抑制SARS-CoV-2复制的NPs。因此，研究人员预期通过初步筛选破坏RBD/ACE2蛋白-蛋白相互作用的能力，可从p-ANAPL中鉴定出具有抗SARS-CoV-2复制活性的NPs。

二、研究内容与主要结论

研究人员筛选了p-ANAPL中213种可获得的物理化合物，以1 μg/mL的浓度检测其破坏SARS-CoV-2刺突蛋白RBD与宿主ACE2受体结合的能力。筛选鉴定出三种抑制至少80% RBD/ACE2结合依赖性发光的化合物：齐墩果酸、poinsettifolin B和rhuschalcone III。另有七种化合物抑制70–80%的结合。三种最活跃化合物的剂量-反应研究表明，齐墩果酸、poinsettifolin B和rhuschalcone III破坏RBD/ACE2结合的IC₅₀分别为2.4、0.50和0.81 μM，约为已建立的RBD/ACE2结合破坏剂(-)-hopeaphenol（IC₅₀ = 0.39 μM）活性的1.3至6.2倍。在选择性方面，三种化合物对PD-1/PD-L1结合对的活性显著较弱，选择性指数分别为齐墩果酸5.2、poinsettifolin B > 21.4、rhuschalcone III > 23.5，表明三者均选择性破坏RBD/ACE2结合。

在病毒复制抑制实验中，齐墩果酸在10 μM时阻断46.6 ± 7.1%的病毒复制，估计EC₅₀为10.8 μM，接近阳性对照瑞德西韦（remdesivir）的活性（10 μM时抑制85.8 ± 11.4%），但其CC₅₀为19.9 μM，抗病毒活性与毒性之间的选择性仅为1.8倍。rhuschalcone III在3 μM时抑制19.9 ± 7.7%的病毒复制，但较高浓度下活性降低，可能与其固有细胞毒性（CC₅₀ = 9.3 μM）有关。poinsettifolin B在任何浓度下均未抑制SARS-CoV-2复制，且表现出可能掩盖其抗病毒活性的细胞毒性（CC₅₀ = 10.8 μM）。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术方法：AlphaScreen蛋白-蛋白相互作用检测技术，用于评估化合物对SARS-CoV-2刺突蛋白RBD与ACE2结合以及PD-1/PD-L1结合的破坏能力；基于Vero-E6细胞的SARS-CoV-2（USA-WA1/2020株）多轮复制细胞病变效应定量检测实验，在生物安全三级（BSL-3）设施中进行；分子对接技术，使用Schr?dinger Maestro软件包中的Glide程序，以SARS-CoV-2刺突蛋白RBD与ACE2复合物的X射线晶体结构（PDB ID: 6M0J）为靶标；MM-GBSA（分子力学-广义Born表面积）方法对对接结果进行重新评分；聚集倾向预测计算；以及基于REINVENT4的mol2mol生成器的生成式建模（de novo设计）用于先导化合物优化。

四、研究结果

p-ANAPL NPs破坏SARS-CoV-2 RBD/宿主ACE2结合。 通过AlphaScreen结合实验筛选213种p-ANAPL化合物，鉴定出齐墩果酸、poinsettifolin B和rhuschalcone III三种化合物在1 μg/mL时抑制至少80%的RBD/ACE2结合。剂量-反应研究确定了三种化合物的IC₅₀值，并证实其对RBD/ACE2结合的选择性优于无关的PD-1/PD-L1蛋白-蛋白相互作用。

p-ANAPL NPs与SARS-CoV-2 RBD和宿主ACE2结合所需氨基酸残基相互作用。 分子对接研究表明，三种化合物的对接分数分别为齐墩果酸-4.312 kcal/mol、poinsettifolin B-4.703 kcal/mol和rhuschalcone III-6.000 kcal/mol，预测结合亲和力顺序为rhuschalcone III > poinsettifolin B > 齐墩果酸。MM-GBSA重新评分的ΔG_bind值分别为-29.29、-34.37和-42.29 kcal/mol，与对接分数趋势一致。范德华相互作用在所有情况下均比静电相互作用贡献更大，表明疏水和空间互补性可能在化合物与RBD/ACE2界面的结合中起主导作用。二维相互作用图显示，齐墩果酸与Gln409和Gln406形成两个常规氢键以及与His34的π-烷基相互作用；poinsettifolin B与His34、Arg403和Gly37形成三个氢键以及与His34的π-π T型相互作用；rhuschalcone III与Asn33、Ala387、Tyr421和Tyr505形成四个氢键以及与Arg393和Lys417的两个π-阳离子相互作用。与关切变异株序列比对表明，齐墩果酸不与任何变异株突变残基相互作用，而poinsettifolin B和rhuschalcone III分别与Omicron变异株中突变的Tyr505以及Beta和Omicron变异株中突变的Tyr505和Lys417相互作用。对与rhuschalcone III结构相似度≥95%的132个类似物的对接研究表明，前12个类似物的对接分数范围为-6.024至-7.495 kcal/mol，均优于母体化合物rhuschalcone III（-6.00 kcal/mol），表明该化学家族可能构成有前景的RBD/ACE2复合物抑制剂。

p-ANAPL NPs在无细胞毒性浓度下抑制体外SARS-CoV-2复制。 在Vero-E6细胞多轮复制实验中，齐墩果酸在10 μM时抑制46.6 ± 7.1%的病毒复制（EC₅₀ = 10.8 μM），rhuschalcone III在3 μM时抑制19.9 ± 7.7%的复制，而poinsettifolin B未表现出抗病毒活性。三种化合物的CC₅₀分别为19.9、10.8和9.3 μM。

p-ANAPL命中物的生成式建模。 使用REINVENT4 mol2mol生成器对三种活性化合物进行de novo设计优化，每种化合物各选出5个预测结合自由能低于母体化合物的虚拟类似物。对于齐墩果酸，主要修饰策略包括减少环数并引入叔丁基酰胺或酯官能团以增加氢键形成能力；对于rhuschalcone III，建议保留联苯醚部分，将末端酚羟基甲基化以降低毒性；对于poinsettifolin B，建议在异戊烯基前引入氧原子以增加氢键形成机会，或将较大的异戊烯基替换为较小的卤素原子。

聚集倾向预测。 计算预测表明三种化合物均不太可能通过胶体聚集等非特异性机制产生表观生物活性，其最近已知聚集剂的Tanimoto相似性系数均低于0.5（除poinsettifolin B的类似物MLS000574837-01的T_c为0.54外）。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，齐墩果酸是一种广泛存在于水果和药用植物中的三萜类化合物，此前已有研究报道其与RBD和ACE2的相互作用以及抑制SARS-CoV-2进入和复制的活性，本研究进一步证实了其选择性。poinsettifolin B和rhuschalcone III则是首次被报道为SARS-CoV-2抑制剂。rhuschalcone III及其类似物代表了有前景的靶向病毒进入的小分子抑制剂设计骨架。对M^pro（主蛋白酶）和RdRp（RNA依赖性RNA聚合酶）的对接分析表明，这些命中物可能与M^pro的相互作用强于RdRp，提示其可能通过额外机制抑制病毒复制。研究局限性包括所用X射线结构（6M0J）缺乏共结晶配体用于对接验证、体外抗病毒实验在Vero细胞中进行可能不能完全反映人呼吸道感染情况，以及计算对接和类似物生成仍属预测性结果，需要实验验证。

结论部分总结指出，从非洲药用植物中获得的NPs仍然是新型抗病毒药物的丰富来源。从p-ANAPL筛选中鉴定出的三种化合物——齐墩果酸、poinsettifolin B和rhuschalcone III——代表了开发未来疗法以及进一步表征药用植物的新化学先导物，这些药用植物可能是在无法获得西方疫苗和疗法的情况下管理SARS-CoV-2及潜在未来冠状病毒感染的本地可及选择。所鉴定的骨架以及计算设计的类似物为旨在提高效力、选择性、药代动力学特性和安全性的药物化学优化提供了起点。更广泛地说，这些发现凸显了系统探索非洲生物多样性和天然产物化学空间用于抗病毒发现和大流行防范的价值。