Na+/K+-ATPase抑制与蛋白激酶C（PKC）信号在双相障碍中的交互作用及氧化应激：来自转化研究的证据

《Neurochemical Research》：Interactions Between Na?/K?-ATPase Inhibition and Protein Kinase C Signaling in Bipolar Disorder: Insights from Translational Data

　　

蛋白激酶C（PKC）失调可影响Na⁺/K⁺-ATPase（sodium-potassium adenosine triphosphatase，钠钾腺苷三磷酸酶）功能，而Na⁺/K⁺-ATPase活性改变反过来可影响PKC通路。因此，本研究采用整合临床前（体外和体内）模型与双相障碍（BD）患者临床数据的转化研究策略，探讨Na⁺/K⁺-ATPase抑制与PKC信号之间的交互作用及其相关氧化应激。在体外模型中，细胞暴露于Na⁺/K⁺-ATPase抑制剂哇巴因（OUA），随后以PKC抑制剂（PKCi——他莫昔芬）处理。在体内模型中，动物接受脑室内（intracerebroventricular，ICV）OUA并给予PKCi治疗。动物接受行为学测试以评估躁狂样和抑郁样行为。临床研究采用病例对照方案，纳入36例BD患者和46名健康对照（healthy controls，HC）。在临床前和临床环境中，评估标志物（4-羟基壬烯醛[4-HNE]、8-异前列腺素[8-ISO]、硫代巴比妥酸反应物质[TBARS]、羰基[carbonyl]和3-硝基酪氨酸[3-nitro]），以及Na⁺/K⁺-ATPase和PKC活性。在体内和体外方案中，OUA增加PKC活性并降低Na⁺/K⁺-ATPase活性。然而，与PKCi联合时，OUA未能抑制Na⁺/K⁺-ATPase活性。此外，OUA能够诱导躁狂样和抑郁样行为及氧化应激，这些也被PKCi逆转。此外，临床方案发现PKC活性增加和Na⁺/K⁺-ATPase活性降低，与临床前方案一致。综上，数据表明Na⁺/K⁺-ATPase与PKC信号通路之间的相互联系是BD病理生理学的重要组成部分。

双相障碍（bipolar disorder，BD）是以躁狂/轻躁狂与抑郁发作交替为特征的重大情感障碍，全球终生患病率约0.6–1.6%。其神经生物学机制复杂，涉及神经递质失衡、线粒体功能障碍、免疫炎症改变及氧化应激等。Na⁺/K⁺-ATPase（钠钾腺苷三磷酸酶）理论可整合上述通路；BD中该酶活性多被报道降低，内源性心脏类固醇（endogenous cardiac steroids，ECS）尤其哇巴因（ouabain，OUA）升高被认为是原因之一，但也有高激活或ECS降低的证据。该酶活性异常可改变神经元活动、氧化应激和细胞生长，并与Akt、ERK、MEK及蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等信号网络交织。PKC参与神经元兴奋性、递质释放、基因表达和可塑性；OUA抑制Na⁺/K⁺-ATPase在特定条件下与PKC激活相关，而PKC又可调节Na⁺/K⁺-ATPase活性、转运和膜表面表达，提示二者可能存在相互反馈，并可能共同影响氧化应激。原文指出，二者精确关系尤其在中枢神经系统组织中仍有文献空白，因此研究人员采用体外、体内和临床相结合的转化方法，探讨Na⁺/K⁺-ATPase抑制与PKC信号及氧化应激的交互作用。研究结论为：OUA增加PKC活性并降低Na⁺/K⁺-ATPase活性；与PKCi联合时OUA未能抑制Na⁺/K⁺-ATPase；OUA诱导躁狂样和抑郁样行为及氧化应激，PKCi可逆转；临床BD患者亦表现为PKC活性升高和Na⁺/K⁺-ATPase活性降低。原文认为，Na⁺/K⁺-ATPase与PKC信号通路的相互联系是BD病理生理学的重要组成部分，为BD理论框架和治疗策略提供了转化证据。

关键技术方法概括（不超过250字）：体外采用7日龄BALB/C小鼠全脑来源细胞，暴露OUA后30 min给予PKCi（10^?6 M）并孵育24 h，检测Na⁺/K⁺-ATPase、PKC活性及氧化/亚硝化损伤标志物；体内采用成年雄性Wistar大鼠，ICV注射OUA（10^?3 M，4 μL）后15 min给予PKCi（10^?6 M，1 μL），于7 d和14 d进行开放场和溅水试验（splash test），并检测全脑生化指标；临床为病例对照研究，样本来自巴西Santa Catarina州Criciúma的UNESC精神病学门诊，对36例BD I型患者和46名年龄、性别匹配健康对照的既往样本进行二次分析，检测红细胞膜Na⁺/K⁺-ATPase、红细胞PKC及血清氧化应激指标。

研究结果：
临床前体外结果：通过BALB/C小鼠脑细胞OUA暴露及PKCi处理，发现OUA降低Na⁺/K⁺-ATPase活性并升高PKC活性；PKCi可逆转OUA对Na⁺/K⁺-ATPase的抑制，单独PKCi可降低PKC活性；OUA升高4-HNE、丙二醛（MDA）、8-ISO、carbonyl和3-nitro，PKCi逆转除8-ISO外多数标志物；PKC与Na⁺/K⁺-ATPase呈很弱负相关（r²=0.32，p=0.009）。
临床前体内结果：通过成年雄性Wistar大鼠ICV OUA及PKCi处理，7 d开放场显示OUA增加跨格、直立和中央区域访问（躁狂样），splash test中梳理行为时间增加，PKCi逆转这些改变；14 d开放场无显著差异，但splash test中OUA降低梳理行为时间（抑郁样），PKCi逆转。7 d时OUA降低Na⁺/K⁺-ATPase活性、增加PKC活性，PKCi逆转OUA对Na⁺/K⁺-ATPase的抑制；PKC与Na⁺/K⁺-ATPase呈很弱负相关（r=0.208，p=0.043）；14 d时Na⁺/K⁺-ATPase和PKC活性均无显著差异，相关不显著。7 d和14 d时OUA均升高4-HNE、MDA、8-ISO、carbonyl和3-nitro，PKCi逆转；14 d时单独PKCi升高MDA。
临床结果：通过病例对照研究，BD患者红细胞PKC活性高于健康对照（mean=3.00，SD=3.30 pmol/min/mg/protein vs. mean=1.90，SD=0.64 pmol/min/mg/protein；U=566.50，p=0.015）；既往报告显示BD患者血清4-HNE、carbonyl、3-nitro和TBARS更高、红细胞Na⁺/K⁺-ATPase更低；BD组PKC与4-HNE（r=0.718，p<0.001）、8-ISO（r=0.689，p<0.001）和carbonyl（r=0.249，p<0.05）正相关；线性回归显示Na⁺/K⁺-ATPase与4-HNE（F(1,34)=4.64，p=0.038；校正R²=0.09）和carbonyl（F(1,34)=11.436，p=0.002；校正R²=0.23）呈负相关，与其他变量无统计学关系。

讨论部分总结：原文讨论认为，OUA在体外和体内均降低Na⁺/K⁺-ATPase，PKCi降低PKC活性；OUA在7 d诱导躁狂样、14 d诱导抑郁样行为。PKCi逆转OUA所致Na⁺/K⁺-ATPase抑制及行为改变，提示PKC可能调节Na⁺/K⁺-ATPase，且OUA的抑制效应及行为结局至少部分依赖PKC激活。原文提出机制涉及OUA结合Na⁺/K⁺-ATPase后激活Src，经表皮生长因子受体（EGFR）、PLC/PIP₂/DAG通路及IP₃介导的Ca²⁺升高激活PKC，PKC再磷酸化Na⁺/K⁺-ATPase的Ser-11和Ser-18等位点并促进内化。原文同时强调他莫昔芬具有多效性，不能据此断言PKC与Na⁺/K⁺-ATPase存在直接且排他的分子交互。临床BD患者Na⁺/K⁺-ATPase低、PKC高，但PKC与Na⁺/K⁺-ATPase的相关和回归分析非显著，原文认为可能与样本多为抑郁或 euthymic 期有关。原文以系统和网络神经生物学视角认为两条通路是复杂细胞网络中的相互连接节点，氧化应激与Na⁺/K⁺-ATPase之间存在正反馈，PKC依赖性氧化/硝化损伤可能参与其中；14 d出现行为与酶活性时间解偶联。局限性包括全脑分析、临床前脑组织与临床血清/血浆样本差异、部分参数变异、缺乏直接分子因果证据、他莫昔芬非特异性、体内仅雄性大鼠而临床以女性为主、临床样本多为抑郁/ euthymic 期而躁狂和混合状态样本少。研究结论（译）：综上，这些涵盖体外、临床前体内和临床数据的转化发现表明，Na⁺/K⁺-ATPase和PKC是BD病理生理学的关键组成部分。这些见解为开发BD的新理论框架和治疗策略开辟了新途径。然而，当前文献仍存在关于这两个系统精确关系的空白，尤其在中枢神经系统组织中。因此，需要进一步研究以直接阐明脑组织中的分子交互。