《Human Genetics》：The impact of nationwide folic acid fortification on genetic variants associated with conotruncal heart defects
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叶酸缺乏与圆锥动脉干心脏缺陷（CTHD）风险增加相关，但其与遗传因素的交互作用仍不清楚。本研究的目的是在全基因组水平上探究常见遗传变异与儿童CTHD及其他心脏缺陷患者在全民强制叶酸强化前后出生之间的关联。测序数据来自儿科心脏基因组学联盟（Pediatric C
叶酸缺乏与圆锥动脉干心脏缺陷（CTHD）风险增加相关，但其与遗传因素的交互作用仍不清楚。本研究的目的是在全基因组水平上探究常见遗传变异与儿童CTHD及其他心脏缺陷患者在全民强制叶酸强化前后出生之间的关联。测序数据来自儿科心脏基因组学联盟（Pediatric Cardiac Genomics Consortium），比对至人类参考基因组（GRCh38/hg38），并经联合处理以确保统一的变异检测并最小化批次效应。分析仅限于欧洲血统推断的个体，限制了对其他祖先群体的普适性。全基因组关联研究（GWAS）模型比较了所有参与者（n=1285）、CTHD亚组（n=534）以及其他心脏缺陷患者（n=751）在不同强化时期的等位基因频率。功能富集分析使用注释、可视化和集成发现数据库（DAVID）进行评估。在完整分析组中，八个位点在强化前后至少有两个提示性变异。在CTHD亚组中，位于DHRS3的两个变异（rs7551703，比值比[OR] 2.10；rs6541043，OR 2.21）以及位于PPARGC1B的四个变异在强化后显示出提示性关联（OR 4.47-4.51）。富集的生物学通路术语与心脏发育过程一致。总之，本研究探讨了叶酸强化与CTHD及其他心脏缺陷遗传风险之间的关联，并识别出与强化时期相关的关联，表明强化后风险发生了一定变化。所识别的通路提示基因-营养互作可能调节心脏发育通路，强调了母体叶酸状态与心血管发育之间的关系。
研究背景与目的
圆锥动脉干心脏缺陷（conotruncal heart defects, CTHD）是最常见的复杂先天性心脏病（congenital heart defects, CHD）类型，源于心脏流出道发育异常。流行病学研究表明，孕期叶酸缺乏与CTHD风险增加密切相关，而围孕期补充叶酸可降低神经管缺陷（neural tube defects, NTD）及CTHD的发生率。然而，多数CHD病因尚不明确，约三分之一的患者可找到明确的遗传病因，其余病例可能归因于多基因风险、基因-环境互作等复杂因素。尽管多项研究探索了叶酸代谢通路基因变异与CTHD的关联，但结论并不一致。1998年，美国食品药品监督管理局（FDA）强制要求在谷物中添加叶酸，这成为一项大规模人群营养干预措施，改变了孕期宫内环境，可能修饰了某些遗传风险变异的外显率或表现度。此前尚无研究直接比较北美地区1998年前后出生的CTHD患儿的遗传变异分布。因此，本研究旨在利用基因组测序数据，探索常见遗传变异与美国叶酸强化政策实施前后出生CTHD患儿之间的关联，以期识别对叶酸敏感的CTHD风险等位基因。
研究方法
研究人员通过NCBI基因型和表型数据库（dbGaP）获取了儿科心脏基因组学联盟（Pediatric Cardiac Genomics Consortium, PCGC）的基因组测序数据（phs001194.v2.p2）。所有参与者均经PCGC统一平台测序并进行协调质量控制，测序读数比对至人类参考基因组（GRCh38/hg38），进行联合变异检出和基因分型。质控标准包括基因型质量（GQ）>20、等位基因读深（AD）>10，排除问题基因组区域，仅保留双等位单核苷酸多态性（bi-allelic SNPs），次要等位基因频率（MAF）>0.01，哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium, HWE）p值>1×10-6。为减少群体分层，仅纳入欧洲血统推断的个体。基于出生年份将受试者分为叶酸强化前（1997年及以前出生）和强化后（2000年及以后出生）两组，排除1998-1999年出生的过渡期个体。全基因组关联分析（GWAS）采用Logistic-Firth混合回归加性遗传模型，以PLINK v2.0.0-a.6.22LM软件执行，纳入前十个主成分作为协变量。功能富集分析使用注释、可视化和集成发现数据库（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID）6.8版，选取各模型中排名前100的基因进行GO、KEGG和Reactome通路富集分析。
研究结果
1. 研究人群特征
PCGC队列中，法洛四联症（tetralogy of Fallot）是最常见的CTHD亚型（54.7%），其次为大动脉转位（D-transposition of the great arteries, 27.1%）等。经质控和欧洲血统限制后，最终分析纳入CTHD患者534例（强化前121例，强化后413例）和其他心脏缺陷患者751例（强化前154例，强化后597例）。
2. GWAS分析结果
未有任何变异达到常规全基因组显著性水平（p<5×10-8），所有结果均在提示性阈值（p<1×10-5）下报告。在全部参与者模型（模型1）中，94个变异显示提示性关联，其中大多数变异在叶酸强化前更为常见（OR<1），提示强化后这些遗传变异在CHD患者中的出现频率下降。在CTHD亚组模型（模型2）中，26个变异显示提示性关联。其中，位于DHRS3基因的两个变异（rs7551703，OR 2.10；rs6541043，OR 2.21）在强化后出生组中频率更高，提示携带这些等位基因的个体在强化后出生概率增加约两倍。此外，位于PPARGC1B基因座内MIR378A区域的四个变异（rs251462、rs32589、rs32585、rs32584）与强化后出生组显著关联，OR值为4.47-4.51。在其他心脏缺陷模型（模型3）中，59个变异显示提示性关联，其中MIR548A1HG和NKX1-1等位点与模型1和模型3均有重叠，提示这些变异并非CTHD特异性，可能反映更广泛的心脏表型共享的遗传易感性。值得注意的是，在所有模型中均未检测到经典的叶酸转运或一碳代谢通路相关变异。
3. 功能富集分析结果
DAVID功能富集分析显示，不同模型呈现不同的富集通路。CTHD组（模型2）中富集的通路包括Rho蛋白信号传导、细胞骨架动力学、细胞-细胞连接、转录调控和细胞内运输等，这些通路与心脏发育核心过程一致。其他心脏缺陷组（模型3）中富集的通路包括染色质结合、基因表达调控和氧化磷酸化等。然而，所有富集项在FDR校正后均未达到统计学显著性，因此应视为假设生成性质。
讨论与结论
本研究通过整合基因组数据和叶酸强化政策的自然实验设计，揭示了叶酸强化可能对CTHD遗传风险产生的影响。在CTHD患者中，DHRS3和PPARGC1B两个基因座的变异在强化后出生组中出现频率升高。DHRS3是一种进化保守的酶，在胚胎视黄醇稳态中发挥关键调控作用，催化全反式视黄醛还原为全反式视黄醇，从而维持适当的细胞内视黄酸水平。视黄酸过多或过少均为已知致畸物，与包括CTHD在内的出生缺陷相关。动物模型研究表明，Dhrs3缺失会导致视黄酸水平升高，引起心脏流出道形成缺陷及心房心室间隔缺损。更重要的是，已有研究证明叶酸补充可挽救视黄酸或其拮抗剂诱导的NTD、腭裂和CHD，提示叶酸与视黄酸信号通路之间存在交叉对话。因此，DHRS3被视为最具复制潜力的候选基因。
PPARGC1B编码PGC-1β，是一种调控心脏发育和线粒体基因表达的转录共激活因子。但PGC-1β主要在胎儿后期和围产期发挥作用，与早期胚胎发生的母体叶酸状态直接交互的可能性较低。研究人员认为，该基因座的关联更可能是由于研究期间CTHD患儿生存率的改善所致——随着产前诊断、重症监护和外科手术的进步，携带影响代谢活性或心力衰竭风险的变异个体得以存活并被纳入PCGC队列，导致其在强化后群体中频率升高。
本研究的主要优势在于将美国叶酸强化政策整合入研究设计，纳入了两年的洗脱期以改善暴露分组准确性，并利用了PCGC高质量的表型和基因组数据。局限性包括：表型异质性、仅报告提示性关联需独立验证、缺乏个体水平的孕产妇膳食和补充剂使用数据、无法区分强化效果与其他时间趋势效应（如产前检测改善、母体特征变化等）、仅限欧洲血统分析限制普适性、仅关注子代遗传效应而非母体遗传效应。
结论：本研究整合了基因组和时间序列数据，揭示了叶酸强化政策如何可能影响CTHD的遗传风险。研究将这一历史政策里程碑作为自然实验，用以检验叶酸-基因型相互作用。重要的是，这些发现超越了历史政策背景，因为许多国家仍未实施强制性叶酸强化，本研究所识别的基因-营养互作可能反映了全球大多数人仍在经历的营养条件。通过利用大型、表型完善的队列，研究人员识别出可能调节心脏发育通路的潜在基因-营养互作。这些发现突显了母体叶酸状态与胚胎视黄醇水平在塑造心血管发育中的复杂相互作用。继续研究基因-营养互作可能为靶向预防策略提供依据，并深化对人群营养政策如何改变遗传易感性外显率及受影响人群基因型组成的理解。
