《Biological Invasions》：Invasive legume leverages rhizobia to increase chemical herbivory defense
编辑推荐：
地点间土壤微生物群落（soil microbial communities）的差异可导致植物表现在不同种群间产生变异；然而，这一关系在入侵植物中仍认识不足。为填补这一空白，研究人员开展了温室实验，所用材料为草本豆科植物 Lupinus polyphyllus，
地点间土壤微生物群落（soil microbial communities）的差异可导致植物表现在不同种群间产生变异；然而，这一关系在入侵植物中仍认识不足。为填补这一空白，研究人员开展了温室实验，所用材料为草本豆科植物 Lupinus polyphyllus，包括来自原产种群和入侵种群的植物。植物分别与来自三个入侵地点的完整土壤接种物（soil inoculum）或高压灭菌土壤接种物共同生长。研究人员测定了植物生长、结瘤（nodulation）、叶片喹诺里西啶生物碱（quinolizidine alkaloids, QAs）以及对蜗牛 Arianta arbustorum 的抗性，并分析了土壤细菌群落。土壤接种物来源对株高、叶片数和总生物碱具有可检测但较小的影响。结瘤正向影响叶片生物碱水平，进而提高对蜗牛取食的抗性。入侵来源与原生来源植物间差异明显，入侵植物在多数性状（植物生长、结瘤、总生物碱、草食动物抗性（herbivore resistance））上优于原生植物。叶片生物碱组成在入侵与原生植物间以及植物器官（叶、根、根瘤）间也存在差异。研究结果表明，根瘤菌（rhizobia）可能通过其对氮可利用性（nitrogen availability）的影响提高植物化学草食动物防御，并提示微生物—植物—草食动物三方互作（tripartite microbe–plant–herbivore interaction）已在入侵地进化，使入侵者显著受益。这些发现为互利土壤微生物及其对广食性草食动物（generalist herbivores）防御的益处如何促进植物入侵提供了新的机制见解。
研究背景与问题：土壤微生物可通过影响植物生长、对拮抗菌的抵抗以及植物种间共存而影响植物入侵结果。有益土壤微生物可间接促进植物生长，例如 mobilizing and enhancing uptake of key nutrients，或通过分泌植物生长促进激素直接促进生长；也可能通过保护植物免受土传病原菌侵染及提高对地上草食动物的抗性而发挥作用。对入侵植物而言，草食动物抗性尤其重要，因为草食动物是植物入侵轨迹的重要驱动因素。敌害释放假说（Enemy Release Hypothesis）认为入侵地缺乏草食动物，防御转移假说（Shifting Defense Hypothesis）认为入侵地草食动物由专食性向广食性转移，二者被认为是塑造入侵植物种群遗传与表型配置的关键驱动因素。增强竞争力进化假说（Evolution of Increased Competitive Ability, EICA）则预测入侵地植物可能更偏向竞争能力。与此相关，入侵地植物对互利微生物在草食动物抗性方面的依赖可能低于原产地植物。根瘤菌是常有益的结瘤共生细菌，可将大气 N
2 转化为氨，为豆科宿主提供氮源；通过提高宿主氮可利用性，根瘤菌可影响依赖氮的植物性状，如生长和化学防御。生物碱是植物产生的含氮专化代谢物，参与对草食动物和病原体的抗性；结瘤和固氮根瘤菌可增强生物碱产生，在某些豆科物种中甚至可触发生物碱生物合成。根瘤菌关联有效性及由此产生的氮可利用性差异，可能导致生物碱产生及抗性差异。土壤微生物对宿主的影响可随宿主种群而变化；根瘤菌群落可能功能多样，专性、广性和无效根瘤菌可共存于土壤中。土壤微生物组成及互利伙伴可用性或病原体存在可随植物群落和非生物环境因素变化。土壤微生物群落也会随入侵历史变化，土传病原体及其对非本地植物的负效应可能随入侵时间延长而更普遍。土壤微生物群落的空间变异可导致植物抗草食动物能力差异，但这种空间异质性是否在入侵植物中产生类似变异仍不清楚。Lupinus polyphyllus (Lindl.; Fabaceae) 是欧洲环境影响和社会经济影响最严重的入侵植物之一，原产北美，在入侵地降低植物群落多样性和节肢动物多样性。在芬兰，入侵 L. polyphyllus 种群主要被广食性蜗牛 Arianta arbustorum 取食，而在原产地则被包括种子捕食者在内的多种节肢动物草食动物取食；该蜗牛不存在于原产地，入侵种群较原产种群已进化出对该草食动物更高的抗性。抗性差异部分由土壤微生物关联驱动，土壤微生物关联也改变植物挥发性有机化合物排放。该物种在叶片产生喹诺里西啶生物碱（QAs），具有防御草食动物功能；在包括芬兰在内的原产地之外易形成根瘤，可与 Bradyrhizobium 和 Rhizobium 属根瘤菌关联，但固氮似乎主要与 Bradyrhizobium 关联。研究人员此前已表明，L. polyphyllus 入侵与原生种群间草食动物抗性差异可由其与土壤微生物的关联解释；土壤微生物对该物种的总体效应多为正，可能反映共生根瘤菌的贡献。由于植物相关土壤微生物组成可随种群变化，其对叶片生物碱及草食动物抗性的影响也可能变化。为检验这一点，研究人员开展受控温室实验，使用原产和入侵种群的植物以及来自三个入侵地点的土壤微生物接种物，测定土壤接种对植物表现、叶片生物碱和草食动物抗性的影响，并在实验结束时表征土壤细菌组成，探索结瘤、叶片生物碱和草食动物抗性之间的关联。研究假设包括：土壤微生物接种对植物生长、结瘤、叶片生物碱和草食动物抗性有正效应；正效应在原产来源植物中强于入侵来源植物，但随土壤接种物来源变化；微生物效应对植物性状影响幅度的变异与土壤细菌组成差异相对应；结瘤与叶片生物碱和草食动物抗性正相关。该研究的意义在于，将互利与拮抗相互作用通过植物化学防御建立机制联系，提示入侵植物可能利用新的有益关联不仅促进生长，也增强其在新拮抗互作中的性状，从而有助于解释单一互利或拮抗假说有时难以解释入侵格局的问题。
关键技术方法（不超过250字）：采用温室全因子实验，将5个芬兰入侵（FI）种群和5个北美原产（US）种群的 L. polyphyllus 种子与来自芬兰西南部3个入侵地点A、G、I的完整或高压灭菌土壤接种物组合；种子于2018年7月采自各种群20株母株，土壤于2021年5月采自10 cm深、每点10 L。测定株高、叶数、生物量、根冠比、结瘤数及活性；用UHPLC-DAD与高分辨质谱定量19种QAs及异构体；用蜗牛 A. arbustorum 进行取食生物测定并以叶面积损失评估抗性；用16S rRNA基因V4区扩增子测序分析土壤细菌，获得扩增子序列变体（amplicon sequence variants, ASVs）；采用线性混合效应模型（linear mixed-effects models, LMM）、广义线性混合效应模型（generalized linear mixed-effects models, GLMM）、置换多元方差分析（permutational analysis of variance, PERMANOVA）和非度量多维尺度（non-metric multidimensional scaling, NMDS）分析。
研究结果：
植物表现（Plant performance）：通过重复测量混合模型分析生长，并测定总生物量、根冠比、结瘤数和结瘤活性。活接种植物在第一次测量时较灭菌接种植物高13%，但该差异后期消失；土壤接种物来源对株高影响总体相似，FI植物在各测量时间均高于US植物，唯第一次测量时接种A点土壤者例外。叶数受植物来源×时间和接种物来源×时间交互影响；US植物在7月平均比FI多1.0片叶，8月多1.4片叶（分别多22%和24%）；生长季末期，接受A接种物的植物比接受I接种物者多8%叶。总生物量、根冠比、结瘤数、结瘤活性常随植物来源不同，但不受土壤接种处理或来源影响。FI植物总生物量高于US（FI 2.26 ± 0.17 g，US 1.81 ± 0.17 g；平均值±标准误）；FI结瘤数多于US（FI 26.2 ± 2.82，US 15.3 ± 1.67个根瘤），且根瘤更可能具有活性（平均概率：FI 0.959 ± 0.025，US 0.792 ± 0.084）。
生物碱与草食动物抗性（Alkaloids and herbivore resistance）：通过LMM分析总叶片生物碱和蜗牛取食叶面积，并以PERMANOVA和NMDS分析生物碱组成。FI植物对蜗牛取食抗性高于US植物，活接种植物抗性高于灭菌接种植物。FI植物总生物碱浓度高于US植物。土壤接种处理与来源存在显著交互：以A点灭菌土壤接种物生长者总生物碱低于以A点活接种物生长者，而其他两点的接种处理效应不存在。19种QAs及异构体在两种来源植物中均存在，但 three of them（butenoyloxylupanine、hydroxybenzoyloxylupanine、vanilloyloxylupanine）在FI植物中明显更常见，lupanine isomer 2在US植物中更常见。植物来源影响叶片生物碱组成；lupanine isomer 1在FI植物中浓度高于US（US 11.11 ± 1.45 mg g
?1，FI 31.38 ± 1.61 mg g
?1）。FI植物中浓度明显更高的还包括hydroxylupanine isomers 3和4、dehydrolupanine、angustifoline、hydroxybenzoyloxylupanine、vanilloyloxylupanine以及cinnamoyloxylupanine isomers 1和3；US植物中浓度更高或个体数更多的为hydroxylupanine isomers 1和2、lupanine isomer 2、tigloyloxylupanine以及cinnamoyloxylupanine isomers 2和4。12株同时采样根和根瘤的植物中，总生物碱含量在根和根瘤中低于叶组织（根49.37 ± 1.08 mg g
?1，根瘤30.58 ± 0.64 mg g
?1，叶65.71 ± 1.22 mg g
?1）；器官间生物碱组成不同，根瘤和根与叶不同。hydroxylupanines 2、3和4在根和根瘤中浓度高于叶，而sparteine、lupanine isomer 2、tigloyloxylupanine、benzoyloxylupanine及所有cinnamoyloxylupanines在叶中更高。叶总生物碱随结瘤数增加而增加，也随根生物量增加而增加；叶总生物碱与取食叶面积负相关，即生物碱浓度较高者抗蜗牛取食更强；结瘤数与取食叶面积也负相关，即“提高”植物草食动物抗性。
土壤细菌群落（Soil bacterial community）：通过16S rRNA扩增子测序、Shannon多样性、PERMANOVA和NMDS分析。完整土壤接种物的细菌多样性总体高于灭菌土壤接种物。接受完整土壤接种物的花盆中，细菌多样性随土壤接种物来源和植物来源变化；在FI植物完整接种处理中，A点土壤者Shannon多样性高于I点微生物群落；灭菌接种土壤者各来源和植物来源间无差异。接种处理对细菌群落组成的影响随接种物来源不同；三个来源的灭菌处理细菌群落彼此相似，而不同来源完整接种花盆的细菌群落彼此不同。接种处理和接种物来源分别解释土壤细菌群落组成变异的15.6%和7.9%。灭菌接种处理中最常见的两个细菌科为Oxalobacteraceae和Chitinophagaceae，完整接种处理中优势科为Chitinophagaceae和Opitutaceae；Bradyrhizobiaceae、Fulvivirgaceae和Sphingomonadaceae属于完整接种花盆中10个最丰富科，Burkholderiaceae、Verrucomicrobiaceae和Oxalobacteraceae属于灭菌接种花盆中10个最丰富科；Rhizobiaceae在I点土壤接种物花盆中属于10个最丰富科，在其他点则否。
讨论总结：土壤微生物被认为可影响植物表现和草食动物抗性，甚至影响植物入侵结果。该研究检验三个入侵地点土壤微生物群落对入侵和原产 L. polyphyllus 表现、叶片生物碱浓度和草食动物抗性的影响。与预期相反，土壤微生物接种物来源对六个性状（株高、叶数、生物量、根冠比、结瘤数、结瘤活性）仅有较小影响；虽然土壤接种对植物表现影响有限，但实验花盆中完整与灭菌接种处理的微生物群落仍明显不同。入侵FI植物在生长、结瘤、草食动物抗性和叶片生物碱方面优于原生US植物；这些性状相互关联：结瘤较多的植物叶总生物碱较高，进而提高对蜗牛取食的抗性。植物生物碱含量在叶与地下组织（根和根瘤）间不同，叶中最高。虽然土壤微生物可改善（入侵）植物表现已有充分认识，但其对入侵植物草食动物的间接效应远不清楚；据原文，该研究属于首批提示互利体—植物—拮抗者互作发生进化变化并可能促进恶性豆科入侵者成功的研究之一。早期株高差异可能说明微生物对生长影响在早期最重要，或细菌随实验进程定殖灭菌花盆；后者得到结瘤数在两种接种处理间无差异的支持。尽管灭菌处理细菌群落与完整处理明显不同，Bradyrhizobiaceae（包含Bradyrhizobium，L. polyphyllus主要固氮共生体）在完整接种中相对更丰富；完整花盆中Oxalobacteraceae在所有接种来源中最丰富，而灭菌花盆中不在10个最丰富科之列，该科某些种可在低氮下通过积累氮和促进根生长改善植物表现，可能补偿灭菌处理氮限制。三个土壤来源中，A点在植物表现和叶总生物碱方面略有不同，可能与此前观察到的初始Bradyrhizobiaceae丰度较高有关。生物碱含氮，因此固氮共生细菌存在可影响豆科生物碱产生；该研究中结瘤较多植物叶总QAs较高，进而对蜗牛抗性更强，提示结瘤及由此产生的氮可利用性是L. polyphyllus防御和草食动物抗性的重要决定因素。与Crotalaria中吡咯里西啶生物碱生物合成限于根瘤、根瘤浓度远高于叶不同，该研究中QAs总浓度叶高于根和根瘤，但某些化合物（hydroxylupanines、dehydrolupanine）在地下部分最高；既往研究表明lupanine和sparteine生物合成发生在叶绿体，而催化hydroxylupanine形成tigloyloxylupanine的酰基转移酶mRNA在幼苗根中高于叶；QAs在L. albus和L. angustifolius韧皮部转运，因此tigloyloxylupanine可能根部合成后运至叶，但需分子机制研究确认；酯型QAs被认为是生物合成终产物及运输和储存主要形式，该研究酯型生物碱在叶中高于根或根瘤。结瘤较多和叶总QAs较高植物被广食性蜗牛A. arbustorum取食较少，与QAs对昆虫、蛞蝓和脊椎动物有毒及Adenostyles alliariae中吡咯里西啶生物碱驱避A. arbustorum的发现一致；此前研究未发现叶生物碱含量与蜗牛取食关联，可能因叶采样与生物测定间隔三个月，而该研究生物测定与生物碱采样连续两天，几乎必然更可靠。虽然预期土壤接种物来源影响草食动物抗性，但未发现；三个地点土壤细菌群落虽略有差异，但不足以转化为抗性差异。植物可通过碳分配、化学信号和养分循环改变根际微生物群落；三个地点均有L. polyphyllus种群至少10年且彼此较近，土壤微生物群落有机会被植物改变和塑造，可能导致跨地点相似的微生物装配效应。入侵FI植物在株高、生物量、结瘤数和活性、叶总QAs浓度及草食动物抗性方面一致优于原生US植物；植物来源也影响叶生物碱组成和多样性，原生US植物生物碱多样性高于入侵FI植物。这些发现部分与既往研究一致，即FI植物更高、草食动物抗性更高、生物碱多样性更低；也部分符合EICA和SDH预测，即入侵来源植物具有更大生长、对广食性草食动物更强防御及对定性毒性防御更大投入；但EICA预测入侵种群防御投入较低，该研究除生物碱多样性外并不支持。与既往研究类似，FI植物结瘤数和活性高于US，可能因接种物来自入侵地而更兼容FI植物。与既往总生物碱浓度在植物来源间相似的结果不同，该研究FI植物总生物碱浓度几乎为US两倍；差异可能归因于采样时间，该研究在生长季末期采样，而既往研究采样新萌发植物；由于A. arbustorum是芬兰入侵种群主要草食动物，该研究观察到的叶总生物碱较高可能反映该广食性草食动物的选择。综合来看，L. polyphyllus似乎能够利用可获得的（推定的）互利体，在入侵地新的互作景观中获得最佳收益。尽管其根瘤菌关联被认为有一定专一性，入侵L. polyphyllus种群已进化出比原产种群更好地从新根瘤菌中获益的能力，并利用这种关联提供的资源产生生物碱，以减少仅存在于入侵地的广食性草食动物的取食。这种进化是否由自然选择导致，还是漂变或奠基者效应等随机过程的结果，尚不确定。尽管如此，原产与入侵种群之间的差异清楚表明入侵植物已与原产植物分化，这种进化可能促进了该物种在入侵地的成功。研究结果与一项模型研究一致，该研究提示互利相互作用可提高外来植物应对入侵地变化草食动物群落的能力；类似地，互利丛枝菌根真菌较未接种对照改善了入侵紫菀 Wedelia trilobata 的生长和抗病性；另一项比较入侵和非入侵外来植物菌根关联与草食动物抗性的研究发现，入侵外来植物总体上并未比外来植物更多受益于互利关联；然而，这些实证研究均未像该研究一样比较同一物种的原产和入侵种群。在该研究中，这种比较揭示，入侵过程中的进化使入侵L. polyphyllus能够通过与新互利体合作并利用这种合作抵御新的广食性草食动物，从而成功继续其入侵轨迹。物种相互作用在决定引入种结果中的作用早已被认识，但相关性状及其权衡多从植物生长和繁殖角度研究；通过植物化学防御将互利和拮抗相互作用以机制联系连接起来，该研究结果提示，入侵植物成功的关键也许部分在于其利用新的有益关联不仅促进生长，还增强其在新拮抗互作中受益的性状。这种灵活性可解释为何仅关注单一互利或拮抗相互作用的入侵假说有时难以解释入侵植物中观察到的格局。理解地上与地下过程之间的联系，以及整合植物互利和拮抗相互作用研究，对于推进植物入侵生物学领域将至关重要。
研究结论（译）：综合来看，L. polyphyllus似乎能够利用可获得的（推定的）互利体，在入侵地新的互作景观中获得最佳收益。尽管其根瘤菌关联被认为有一定专一性，入侵L. polyphyllus种群已进化出比原产种群更好地从新根瘤菌中获益的能力，并利用这种关联提供的资源产生生物碱，以减少仅存在于入侵地的广食性草食动物的取食。这种进化是否由自然选择导致，还是漂变或奠基者效应等随机过程的结果，尚不确定。尽管如此，原产与入侵种群之间的差异清楚表明入侵植物已与原产植物分化，这种进化可能促进了该物种在入侵地的成功。研究结果与一项模型研究一致，该研究提示互利相互作用可提高外来植物应对入侵地变化草食动物群落的能力；类似地，互利丛枝菌根真菌较未接种对照改善了入侵紫菀 Wedelia trilobata 的生长和抗病性；另一项比较入侵和非入侵外来植物菌根关联与草食动物抗性的研究发现，入侵外来植物总体上并未比外来植物更多受益于互利关联；然而，这些实证研究均未像该研究一样比较同一物种的原产和入侵种群。在该研究中，这种比较揭示，入侵过程中的进化使入侵L. polyphyllus能够通过与新互利体合作并利用这种合作抵御新的广食性草食动物，从而成功继续其入侵轨迹。
