《Plant Molecular Biology》：PPR9 mediates mitochondrial nad transcript maturation required for complex I biogenesis and early plant development in Arabidopsis
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植物线粒体的生物发生与功能依赖于细胞器基因组的表达，该过程涉及细胞器转录本的广泛转录后加工，以生成成熟的功能性RNA。其中包括通过剪接去除许多必需细胞器转录本中的内含子，该过程由多种核编码的RNA加工因子介导，包括三角状五肽重复（pentatricopepti
植物线粒体的生物发生与功能依赖于细胞器基因组的表达，该过程涉及细胞器转录本的广泛转录后加工，以生成成熟的功能性RNA。其中包括通过剪接去除许多必需细胞器转录本中的内含子，该过程由多种核编码的RNA加工因子介导，包括三角状五肽重复（pentatricopeptide repeat, PPR）蛋白家族的众多成员。本文报道了PPR9（At1g03560）的分析，这是一种线粒体P类PPR蛋白，最初在必需蛋白辅因子的遗传筛选中被鉴定。PPR9功能缺失导致种子发育早期胚胎停滞。利用改良的体外胚胎拯救方法，研究人员可以恢复并维持体外拯救的纯合ppr9突变体植株。突变体表现出生长和发育延迟，这与线粒体功能改变相关。分子分析揭示，PPR9在多个编码呼吸复合物I（complex I, CI）亚基的线粒体转录本的剪接中发挥作用，包括nad2内含子3以及nad7内含子1和2。相应地，ppr9植株中CI组装被破坏，导致氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）活性改变和广泛的生理缺陷。总之，这些发现将PPR9确定为拟南芥线粒体RNA（mitochondrial RNA, mt-RNA）成熟的关键调控因子，使CI生物发生和最佳呼吸功能得以实现，并进一步突出了核编码因子在协调线粒体功能与（早期）植物生长发育中的作用。
**研究背景与科学问题**
线粒体是真核生物能量代谢和信号传导的中心细胞器。植物线粒体基因组（mitochondrial genome, mtDNA）在大小和结构上远比动物线粒体基因组复杂，且其转录本需要经历广泛的转录后加工，包括末端修剪、RNA编辑和内含子剪接，才能生成成熟的rRNA、tRNA和mRNA。植物线粒体基因中含有大量II型内含子（group II intron），这些内含子的剪接需要多种核编码的RNA结合蛋白参与，其中三角状五肽重复（pentatricopeptide repeat, PPR）蛋白家族是最大的参与者之一。尽管PPR蛋白的RNA识别代码已被部分解析，但PPR蛋白如何促进内含子剪接的具体分子机制仍不清楚。因此，鉴定和解析参与线粒体RNA剪接的关键PPR因子，对于理解植物线粒体基因表达调控及其与生长发育的联系具有重要意义。
**研究内容与结论**
研究人员通过反向遗传学方法，分析了拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中一个预测定位于线粒体的P型PPR蛋白PPR9（At1g03560）。研究人员从TAIR数据库获取了相应T-DNA插入突变体（SALK_004994），发现纯合突变体导致胚胎发育早期停滞，种子皱缩且无法在常规条件下萌发。利用改良的体外胚胎拯救方法，研究人员成功获得并维持了纯合ppr9突变体植株，并构建了35S::PPR9转基因互补系以验证表型与PPR9基因座的特异性关联。分子分析表明，PPR9参与多个编码呼吸复合物I（complex I, CI）亚基的线粒体转录本的剪接，特别是nad2内含子3以及nad7内含子1和2。这些剪接缺陷导致CI全酶组装受损，进而改变氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）活性，并触发替代呼吸途径（如交替氧化酶AOX和II型NAD(P)H脱氢酶ND）的上调。呼吸活性测定显示，ppr9突变体对CI特异性抑制剂鱼藤酮的敏感性显著降低，表明其呼吸链更多依赖替代途径。这些结果确立了PPR9作为线粒体RNA成熟关键调控因子的地位，其功能对CI生物发生和早期胚胎发育至关重要。
**关键技术方法**
研究人员主要使用了以下技术方法：利用公共数据库和预测工具进行基因结构、蛋白定位及RNA结合位点分析；通过GFP融合蛋白在*Physcomitrium patens*原生质体中的瞬时表达进行亚细胞定位验证；采用拟南芥Col-0生态型、T-DNA插入突变体（SALK_004994，来自ABRC）及转基因互补系，通过体外胚胎拯救获得纯合突变体；运用RT-qPCR和RNase保护实验系统分析线粒体23个内含子的剪接效率；采用蓝绿温和聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）结合免疫印迹检测呼吸复合物组装；使用Clark型氧电极测定整体呼吸活性。
**研究结果**
**1. PPR9属于一个预测定位于线粒体的P型PPR蛋白**
通过生物信息学预测和AlphaFold结构分析，PPR9含有13个经典PPR基序（P1-P13）及一个非经典PPR基序（P*），N端含有线粒体靶向肽（mTP）。基于PPR代码的RNA结合位点预测虽在nad2内含子3和nad7内含子1、2中发现潜在位点，但整体预测较宽泛，强调了实验验证的必要性。
**2. PPR9是一个低表达且定位于线粒体的PPR蛋白**
公开转录组数据显示PPR9在胚胎、年轻叶片、花等组织中表达较高。GFP融合蛋白定位实验证实PPR9定位于线粒体，与MitoTracker共定位，未发现叶绿体或细胞核信号。
**3. PPR9功能是拟南芥早期胚胎发育所必需的**
杂合ppr9植株的自交后代中约24%的种子皱缩，显性遗传分析符合1:3分离比例（胚胎致死）。显微观察显示纯合突变体胚胎在鱼雷形至拐杖形阶段停滞。通过体外胚胎拯救方法，研究人员获得纯合突变体植株，但这些植株生长迟缓，不能完成生活史，与线粒体功能缺陷突变体的典型表型一致。
**4. PPR9参与nad2和nad7 RNA转录本加工**
RT-qPCR分析显示，ppr9突变体中nad2外显子3-4、nad7外显子1-2及2-3的成熟转录本水平显著下降，而其他线粒体转录本基本不受影响。互补系中这些转录本恢复至野生型水平，证实PPR9特异性影响nad2和nad7转录本成熟。
**5. PPR9对nad2内含子3和nad7内含子1和2的高效剪接至关重要**
通过RT-qPCR定量23个线粒体内含子的剪接效率，发现ppr9中nad2内含子3的剪接效率降低约1000倍，nad7内含子1和2分别降低约30和60倍，其他内含子剪接基本正常。RNase保护实验进一步验证了这些剪接缺陷，并观察到nad2内含子2前体RNA的积累，可能由于nad2反式剪接的级联效应所致。
**6. PPR9缺失破坏线粒体复合物I的组装与功能**
BN-PAGE结合免疫印迹显示，ppr9突变体中CI全酶量显著降低，并出现约800-850 kDa的CI组装中间体（CI*），以及较低分子量的膜臂组装中间体。同时，CIII2、CIV和CV的稳态丰度有所增加，表明呼吸链发生了重塑。免疫印迹显示AOX1a蛋白大量积累，RT-qPCR证实AOX1a、AOX1c、AOX1d、NDA2、NDB2等替代途径基因转录水平上调。呼吸活性测定显示ppr9总耗氧率与野生型相近，但鱼藤酮敏感性明显降低，而KCN与SHAM联合处理几乎完全抑制呼吸，表明突变体呼吸依赖替代途径。
**总结讨论**
讨论部分指出，PPR9是线粒体CI生物发生的关键因子，其功能缺失导致CI组装缺陷和早期胚胎致死。PPR9属于特异性作用于少数内含子的P型PPR蛋白，与一些作用于多个内含子的因子（如RNA解旋酶、maturase）不同。尽管PPR代码未能给出高精度预测，但实验验证了nad2和nad7的特定内含子为其直接或间接靶标。PPR9缺失引起的CI缺陷触发了替代呼吸途径的补偿性上调，这可能通过线粒体逆行信号实现，以维持电子流和能量稳态。此外，胚胎拯救的成功表明外源糖和维生素可部分补偿代谢缺陷，但无法完全恢复生活力，说明PPR9介导的线粒体RNA成熟对胚胎发育的不可替代性。
**研究结论**
总之，这些数据表明，CI生物发生和活性在ppr9突变体中受损。ppr9呼吸对鱼藤酮的敏感性降低，加之替代呼吸组分的诱导，与对替代电子传递途径的依赖性增加相一致。这些结果确立了PPR9作为拟南芥线粒体nad转录本成熟的关键调控因子，使CI生物发生和最佳呼吸功能得以实现，并进一步凸显了核编码因子在协调线粒体功能与（早期）植物生长发育中的重要作用。
