《Aquaculture International》：Occurrence of spinal deformities in pikeperch (Sander lucioperca) early life stages in relation to size grading: a case study from a commercial hatchery
编辑推荐：
脊椎畸形（vertebral deformities）仍然是梭鲈（Sander lucioperca）水产养殖面临的重大挑战。畸形在幼鱼（fingerlings）中的出现进一步减少了本已不多的适合养成（grow-out）的鱼数量，从而整体限制了梭鲈养殖业的发展
脊椎畸形（vertebral deformities）仍然是梭鲈（Sander lucioperca）水产养殖面临的重大挑战。畸形在幼鱼（fingerlings）中的出现进一步减少了本已不多的适合养成（grow-out）的鱼数量，从而整体限制了梭鲈养殖业的发展。机械胁迫（mechanical stress）已被证明会影响畸形发生率，且近期研究描述了分级操作（grading procedures）与脊柱形成关键发育步骤在时间上的重叠。在此背景下，本研究调查了梭鲈早期发育阶段在分级期间脊椎畸形的发生情况。采样紧随前三次人工分级步骤进行，并包含由分选步骤产生的不同大小组别的样本。研究人员通过形态计量比较（morphometric comparisons）以及对透明染色（cleared and stained）标本的形态学分析，对小个体组和大个体组进行了比较。形态计量数据证实分级产生了明显不同的大小组别；然而，同类相食（cannibalism）未能完全消除。最大体宽与所用栅格间距之间的差异提示分选过程中对鱼体施加了机械压力。形态学检查显示脊椎压缩（vertebral compressions）和融合（fusions）随时间增加。值得注意的是，在首次采样中即观察到横向变形的脊椎/脊索（notochord）区域，表明发育前体从早期阶段就承受了胁迫，这可能导生长效影响和脊柱畸形。后期畸形率的上升与这些阶段骨化（ossification）的进展在时间上吻合。从这一养殖场实例中获得的见解表明，分级程序的调整具有减少脊柱畸形发生的潜力。示例性的方案调整可改善梭鲈苗种培育（larviculture）、提高动物福利并增加经济效益。
论文解读
一、研究背景与目的
梭鲈（Sander lucioperca）是欧洲水产养殖重点推广的关键经济鱼类之一，因其市场价格较高，对推动集约化循环水养殖系统（recirculating aquaculture systems，RAS）的发展日益重要。然而，梭鲈养殖仍面临诸多限制，尤其是缺乏足够数量的优质幼鱼用于养成阶段的生产。早期发育阶段死亡率高、因显著的大小异质性导致的同类相食频发，以及以脊柱畸形为主的骨骼畸形问题持续存在，共同制约了梭鲈养殖业的整体发展。
骨骼畸形的诱发因素广泛，其中机械胁迫已被证实具有显著影响。高游泳活动可导致真鲷（Pagrus major）和斑马鱼（Danio rerio）出现脊柱畸形，高呼吸频率可改变真鲷鳃盖形态。水产养殖环境中的操作处理（handling procedures）是公认的机械胁迫源，可导致皮质醇水平升高并增加损伤风险。为减轻与大小差异相关的同类相食，苗种场普遍采用规格分级操作。对于最早期的阶段，分级通常以人工方式进行，即将批量鱼体冲过具有特定间距栅条的栅格，依据最大体宽进行分选。然而，这些操作在早期阶段对骨骼发育的潜在副作用尚未得到充分认识。
梭鲈的脊柱沿脊索发育，脊索是由液泡填充、稳定胚胎体轴的管状结构。椎体（centra）以脊索鞘内的钙化形式开始形成，随后神经弓和脉管弓从软骨前体背腹向发育，与椎体融合形成弓椎体（arcocentrum），最终成熟为完整椎骨并持续骨化。此前研究已表明，对发育前体尤其是脊索的损伤可对脊柱产生持久影响。因此，分级操作与这些关键发育过程的时间重叠可能构成脊柱畸形的重要诱因。本研究旨在通过结合形态计量与定量形态学评估，并随时间进行比较，阐明养殖条件下分级操作过程中处理和管理相关的机械影响如何促成早期脊柱异常，为制定减少畸形发生率的策略提供依据，从而兼顾经济效益与动物福利。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员从德国一家商业化梭鲈苗种场获取样本。受精卵在McDonald-Jar中孵化，仔鱼转移至培育缸饲养至29日龄（days post hatch，dph），随后转移至较大的幼鱼养殖系统。培育期间水温从13.5°C缓慢升至19.0°C，pH为7.9，溶解氧为6.5–7.0 mg/L。自3 dph起投喂丰年虾（Artemia）无节幼体，23 dph起转为颗粒饲料。
规格分级自33 dph开始（分级I），随后在42 dph（分级II）和50 dph（分级III）进行，第四次分级前（57 dph）采集最后一批样本。分级采用固定间距栅格盒（2.0和2.5 mm）和可调间距栅格盒（3.0–6.0 mm）。产生的规格等级标记为S（小）、M（中）、L（大）和XL（特大）。每个采样组随机采集40尾标本，共920尾，以MS222过量麻醉处死后保存于70%乙醇中。
主要技术方法包括：外部形态分析——测量总长（TL）、第一背鳍前缘处体宽（BWD1）和体重，并评估鳔充气状态；透明与双重染色——对L和S组及首次分级前组各20尾标本（唯一例外为IV L pre组仅15尾）采用Taylor和Van Dyke方法进行阿利新蓝（Alcian blue）软骨染色和阿利红（Alizarin red）钙化结构染色，随后在体视显微镜下逐椎检查变形状态；统计分析——采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验或Welch-ANOVA及Games–Howell检验比较组间差异，采用广义线性模型（GLM，family=quasibinomial）分析分级步骤、规格等级和分级状态（分级前/后）对椎骨异常率的影响。
三、研究结果
形态计量变化与分级效率
各组总长范围为19.8±1.5 mm（I S post）至61.7±7.9 mm（IV XL pre）。分级后各组在多数情况下呈现显著长度差异，但分级III后的S和M组除外；分级后标准差亦有所减小。体重范围为0.07±0.02 g（I S post）至2.82±0.77 g（IV XL pre）。超过组平均体重两倍的个体出现在I 0 pre（n=2）、II L post（1）、III L pre（2）和III XL post（1）组中，其中两只标本体内含有未消化的同类个体，表明同类相食在首次分级前即已发生。BWD1范围为2.5±0.3 mm至8.6±1.0 mm，与TL保持约7.9±0.42的稳定比值。将BWD1与所用栅格间距比较发现，除II L post组外，所有组别的最大栅格间距均小于平均BWD1，差异最高达平均BWD1的28%，表明分级过程中确实对鱼体施加了机械力。所有分析标本均观察到鳔充气正常。
脊柱中观察到的变形
脊椎压缩（VC）的总体发生率（25.9%的标本）高于脊椎融合（VF，3.9%）。VC沿脊柱大部分区域分布，在体中部约50–60%脊柱长度处及尾部区域约75%和95%脊柱长度处发生率略高。最早阶段各组压缩发生率较低且不规律，第二次分级后的样本组（≥43 dph）后部脊柱（≥40%脊柱长度）压缩发生率增加，第三次分级后进一步集中于约60%脊柱长度以后区域。VF主要见于最年长和最大的IV L pre组，集中于后部脊柱（≥55%脊柱长度）；其他组仅有零星发生，包括最早期的样本。GLM分析显示，分级步骤II和IV对椎骨异常率有显著影响（p=0.019，p=0.038），分级步骤III呈边缘性增加（p=0.06）；规格等级和分级状态（分级前/后）无显著影响。
值得注意的是，横向加宽的脊柱区域仅在首次分级前后的三个组别中观察到且发生率较高，可分为背腹向加宽（NC dor）和侧向加宽（NC lat）两种类型。NC dor见于55%的标本，NC lat见于33.3%的标本，两者均主要影响I S post组。该组中NC dor分布于25–90%脊柱长度，以40–50%脊柱长度处发生率最高（80%）；NC lat分布于25–100%脊柱长度，集中于55–60%脊柱长度处（65%）。I L post组仅观察到NC dor，分布于35–50%脊柱长度（10%的标本）。由于这些阶段脊柱骨化程度最低，这些变形很可能反映了对脊索的影响。较大个体受影响程度较低，可能因其发育进程较快、暴露于不利条件的时间较短。
脊柱相关骨骼元素的骨化进展
肋骨数量从I 0 pre和I S post组的零根增加到IV L pre组的最高22根，第三次分级前后骨化趋于平稳在19–22根。肌膈间肌间骨（epicentral intermuscular bones）数量以略有延迟的方式相似增加，从零到IV L pre组的最高17根，该组平均达15.7根。骨化进展与椎骨变形率的后期上升在时间上吻合。
四、讨论与结论
讨论
本研究在养殖场实例中观察到畸形随时间渐进增加，这一趋势与分级步骤及标本的持续发育相吻合。压缩和融合在脊柱后半部发生率较高，提示梭鲈这些椎骨区域对机械压力具有局部易感性，可能与该区域形态上较不坚固、受肋骨或肌间骨等周围骨骼元素保护较少，以及运动相关肌肉活动产生的力有关。压缩率较高而融合出现较晚的现象似乎与骨骼骨化和矿化的进展相关，后期融合可能是对已压缩椎骨持续机械应力的适应形式。早期分级前观察到的零星融合事件可能源于先前存在的畸形而非分级造成的机械胁迫。最早阶段观察到的横向加宽脊索/脊柱区域表明脊索受到了某种影响，鉴于此前斑马鱼研究已证明机械影响对脊柱的持久效应，这进一步强调了早期生活阶段的影响对梭鲈长期脊柱发育的重要性。较大个体受影响较少可能反映了发育进程的差异。分级操作引起的个体间混合以及较大组中可能混入的同类相食个体可能对结果产生一定影响。
结论
在本研究观察的生产批次中，梭鲈早期发育阶段脊柱变形的分析显示畸形随时间增加，这与脊柱持续骨化相吻合。形态计量参数与所用栅格尺寸的比较表明分级过程中对鱼体施加了压力。在最早期的样本组中，即本研究首次分级时间点前后，发现了背腹向和侧向加宽的脊柱区域，这与对早期脊柱结构的影响相关，且较小个体这些畸形类型的发生率较高。研究提出了首次规格分级程序的调整建议，即选择性移除较大个体并减少早期分级过程中的栅格通过次数。本案例研究获得的见解有助于降低畸形率，从而改善梭鲈养殖和 aquaculture 系统中的动物福利。
