可食植物中phytaspase蛋白酶活性高度变异及辣椒（Capsicum annuum）CaPhyt的鉴定与人胃泌素体外水解

《Biochemistry (Moscow)》：High Variability of Phytaspase Proteolytic Activity in Plants of Various Species: Possible Implications

　　

Phytaspases（植物蛋白酶）是参与胁迫诱导植物细胞死亡的植物蛋白酶。它们与动物凋亡蛋白酶（caspases）具有相同底物特异性，并对其蛋白质底物表现出高选择性。此前已证明，水稻phytaspase可水解并因此灭活异源蛋白人胃泌素（gastrin），一种肽类激素。由于降低胃泌素水平可能在若干人类病理状况中获益，研究人员比较了广泛可食植物中的phytaspase活性。Phytaspase活性变化达1至2个数量级，即使在亲缘关系密切的植物物种间亦然。研究人员从辣椒果实（Capsicum annuum）中分离并鉴定了phytaspase，该材料为活性最高的植物材料之一，制备了重组酶，并表征了其部分生化特性，包括底物特异性。研究人员进一步证明，辣椒phytaspase在体外（in vitro）有效水解人胃泌素。这些发现支持进一步实验研究以下假设：食用辣椒可能降低人体内胃泌素水平。

研究背景与问题：Phytaspase（植物蛋白酶，参与胁迫诱导的植物细胞死亡）与动物凋亡蛋白酶（caspases）在底物水解选择性上高度相似，均在天冬氨酸残基之后切割肽键，但二者结构完全不同：caspases为半胱氨酸依赖蛋白酶，而phytaspases为subtilase（枯草杆菌蛋白酶样）家族丝氨酸依赖酶。Phytaspases以无活性前体合成，通过组成型自催化激活；正常条件下活性酶分泌至质外体（apoplast，细胞外间隙），在诱导细胞死亡胁迫下经网格蛋白依赖性内吞（clathrin-dependent endocytosis）返回细胞并接触靶蛋白。由于选择性极高，已知靶蛋白很少，包括系统素（systemin）和植物硫肽素（phytosulfokine）前体、内质网伴侣蛋白calreticulin-3及农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）VirD2等。此前发现水稻phytaspase可在体外对人及动物消化激素胃泌素（gastrin）和胆囊收缩素（cholecystokinin）引入单一切割并使其失活，但该特性是否仅属水稻phytaspase、食用植物食品后能否在人和动物体内发生尚不清楚；降低这些肽激素活性在多种人类病理状况中可能有益。因此研究人员比较不同物种可食部位phytaspase活性，并若发现高活性代表则表征该酶并评估其水解动物肽类消化激素的能力。

研究人员开展的工作与结论：研究人员比较了约50种植物可食部分提取物的phytaspase蛋白酶活性，发现活性可相差1至2个数量级；选择活性高的辣椒果实分离鉴定辣椒phytaspase（CaPhyt），制备重组酶，表征pH最适范围和底物特异性，并证明CaPhyt可在体外高效水解人gastrin-1。该研究支持进一步实验检验“食用辣椒可能降低人体胃泌素水平”的假设，并为筛选富含phytaspase的可食植物及胃泌素调控策略提供依据。

关键技术方法（不超过250字）：可食植物材料来自市场不同供应商，Nicotiana benthamiana为实验室土培。研究人员制备植物组织提取物，以荧光肽底物Ac-IWLD-ACC和Ac-VEID-AFC测定phytaspase活性；辣椒果实内源CaPhyt经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换层析及biotin-DEVD-CHO/avidin亲和层析分离；以质谱鉴定蛋白；克隆CaPhyt基因，在N. benthamiana中经农杆菌浸润表达C端His₆标签重组蛋白，并经Ni-NTA琼脂糖纯化；用质谱分析重组CaPhyt对gastrin-1的水解。

研究结果：Phytaspase activity in edible plants of different species varies markedly（不同物种可食植物中phytaspase活性差异显著）。研究人员从约50种植物可食部分制备总提取物，以两种不同结构的荧光底物Ac-IWLD-ACC和Ac-VEID-AFC测定活性，发现不同物种间活性可变化1至2个数量级；芹菜、香菜和龙蒿叶活性最高，蔬菜中辣椒果实最高，水果中鳄梨最高；苹果、柠檬、柑橘、越橘、蔓越莓、胡萝卜、甜菜根、番茄果实和大蒜鳞茎等活性极低。同一物种不同供应商样本活性差异不超过2倍；甜椒、红椒、橙椒和辣椒等Capsicum果实均显示较高且相近活性；发育阶段可影响活性，幼嫩芹菜叶活性极高而成熟叶和茎下降数倍；辣椒与番茄虽同属Solanaceae但活性差异显著。据此研究人员选择辣椒Capsicum annuum的CaPhyt进一步表征。

Identification of pepper phytaspase CaPhyt（辣椒phytaspase CaPhyt的鉴定）。研究人员从成熟红辣椒果实提取物经多步色谱分离，最终利用phytaspase与可逆抑制剂biotin-DEVD-CHO复合物在avidin树脂上的亲和层析获得CaPhyt制品；变性凝胶电泳显示主要条带约80 kDa。质谱分析显示该蛋白与辣椒subtilase相似，最佳匹配为预测的subtilisin-like protease SBT1.9（XP_016550861.1）；克隆基因序列与参考基因比较发现参考基因含15和117个核苷酸缺失，而克隆序列无此差异，研究人员将所得序列存入GenBank（MT407573.1）。随后在N. benthamiana中经农杆菌浸润表达带C端His₆标签的重组蛋白，从生产者叶片质外体收集并经Ni-NTA琼脂糖纯化；重组蛋白可水解Ac-IWLD-ACC，pH最适为4.0-6.5，符合多数已知phytaspase特征，故命名为C. annuum phytaspase（CaPhyt）。

Substrate specificity of CaPhyt（CaPhyt的底物特异性）。研究人员用不同X-X-X-D-AFC荧光肽检测重组CaPhyt的水解能力，发现CaPhyt最有效水解Ac-VNLD-AFC，对Ac-VEID-AFC、Ac-IETD-AFC和Ac-VAD-AFC也有较高水解效率；当AFC荧光基团连接于非Asp残基时，水解不发生或极低。由此研究人员确认已鉴定辣椒phytaspase CaPhyt、描述其底物特异性并获得足量重组酶供后续研究。

Can CaPhyt hydrolyze human gastrin?（CaPhyt能否水解人胃泌素？）。研究人员用纯化CaPhyt处理人gastrin-1，并以质谱比较处理与未处理样品，发现CaPhyt在GWMD↓位点高效水解gastrin-1，切下C端酰胺化苯丙氨酸残基（GWMDFNH₂相关C端），文献报道此类截短可完全灭活gastrin。据此研究人员认为，利用辣椒phytaspase或辣椒本身调控动物体内gastrin水平可能可行。

讨论总结：作者指出，不同物种可食部位phytaspase活性差异可极大，甚至近缘植物同一部位也可达10倍以上；基于实验室植物数据可推测存在差异，但达到1至2个数量级仍出乎预期。作者提出，辣椒与番茄果实对活性phytaspase需求差异的可能解释包括：空心辣椒果实形成可能需要phytaspase参与定向清除果实内部多余细胞，或二者果实发育/成熟对phytosulfokine、systemin等活性肽激素需求不同。应用方面，可食植物phytaspase在体外可高效水解并灭活动物gastrin，提示食用富含此类酶的植物可能降低人和动物体内gastrin水平。Gastrin由胃细胞合成前体，经多阶段加工为gastrin-17、gastrin-34等活性形式，响应进食和炎症分泌入血，结合受体促进盐酸分泌；gastrin基因也在非内分泌细胞尤其肿瘤细胞中活跃，gastrin可刺激细胞增殖。因此，多种胃肠病理中减弱gastrin作用具有可取性；作者认为所提出的方法可补充现有旨在使用gastrin受体拮抗剂的药理学策略，但仍需进一步研究。研究结论可译为：这些发现支持进一步实验研究以下假设：食用辣椒可能降低人体内胃泌素水平；研究人员认为，所提出的方法可补充现有旨在使用胃泌素受体拮抗剂的药理学策略，但仍需进一步研究。