血小板中Cyclophilin D依赖性坏死的动态变化与调控

《Biochemistry (Moscow)》：Dynamics and Regulation of Cyclophilin D-Dependent Necrosis in Platelets

　　

血小板的强烈生理性激活会导致一个不可聚集的促凝血亚群的出现，其特征是磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）暴露于质膜外叶，为凝血反应提供表面。促凝血血小板的形成被认为是线粒体钙超载引发的亲环蛋白D（cyclophilin D, CypD）依赖性线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）开放所致；然而，钙进入的机制以及随后的坏死机制尚未被最终确定。研究人员采用连续流式细胞术，通过监测胞质钙动态（Fura Red）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平（CM-H₂DCFDA）、质膜完整性（calcein）、线粒体膜电位[DiOC₆(3)]、荧光纤维蛋白原结合以及促凝血活性（annexin V），分析了血小板刺激后该过程的主要阶段。受体刺激通过一个中间血小板亚群诱导促凝血血小板形成，该亚群的特征是线粒体去极化，但质膜保持极化且磷脂酰丝氨酸水平升高。在早期激活阶段（小于5 min），ROS在磷脂酰丝氨酸含量升高的亚群中急剧增加，并在非促凝血亚群中稳步增加；到15 min时，两个群体中的ROS水平相当。在激活过程中的任何时间点添加质子载体羰基氰化物间氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone, CCCP）均不影响促凝血血小板的形成。然而，在预先用亲环蛋白D抑制剂环孢素A（cyclosporin A, CsA）孵育的血小板激活过程中添加CCCP，则导致爆发性坏死。CCCP也增加了静息血小板中的钙浓度。这些数据有助于解释CCCP对血小板坏死的矛盾效应，并强调了电压依赖性线粒体钙积累的重要性。研究结果进一步提示ROS在血小板坏死中的意义，而膜完整性的丧失似乎是继发过程。

论文解读

研究背景与目的：哺乳动物血小板是无核盘状细胞，主要功能是止血，包括形成聚集体和加速膜依赖性凝血反应。生理性激动剂如凝血酶和胶原可诱导血小板出现一个不可常规聚集的促凝血亚群，该过程被视为一种坏死性死亡。促凝血血小板表面暴露磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS），但整合素失活，不能参与常规聚集，却能通过表面固定的纤维蛋白原与常规活化血小板形成聚集体。促凝血血小板呈球形、胞质钙持续升高、细胞骨架解体、质膜完整性丧失并可产生微囊泡，对正常止血和多种病理过程有重要意义。该亚群形成被认为依赖于亲环蛋白D（cyclophilin D, CypD）调控的线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）开放；钙信号是主要诱因，线粒体通过电位依赖性方式积累钙，最终导致线粒体膜电位丧失和血小板死亡。然而，钙进入线粒体的具体机制、线粒体释放钙后引发坏死的下游过程，以及活性氧（reactive oxygen species, ROS）和质膜损伤的作用等仍存在争议。为此，研究人员利用连续流式细胞术，在刺激PAR1、PAR4和GPVI受体的条件下，系统分析了CypD依赖性血小板坏死各阶段。

研究内容与结论：研究人员使用健康成年志愿者静脉血（经伦理委员会批准）分离血小板，同时监测胞质钙、线粒体膜电位、ROS、质膜完整性、整合素活性和促凝血活性。结果表明，受体联合刺激通过一个中间血小板亚群形成促凝血血小板：该亚群线粒体已去极化，但质膜仍保持极化且PS暴露升高。早期激活阶段ROS在促凝血亚群急剧升高，随后趋同；质膜完整性丧失发生较晚，不是坏死启动因素。线粒体在正常激活时通过电位依赖性钙单向转运体（mitochondrial calcium uniporter, MCU）积累钙；阻断mPTP（环孢素A, CsA）抑制坏死，而去极化线粒体后再激活则抑制坏死，说明线粒体快速释放钙是触发坏死的必要条件。这些结果阐明了CypD依赖性血小板坏死的动态和调控机制。

关键方法：研究采用连续流式细胞术，用Fura Red监测胞质钙并以Fura Red荧光比值（RFR）表示，DiOC₆(3)监测线粒体膜电位，annexin V判断促凝血活性，CM-H₂DCFDA检测ROS，calcein判断质膜完整性，纤维蛋白原-AF488检测整合素激活。血小板来自健康成年志愿者，经枸橼酸钠抗凝和差速离心分离；以PAR1、PAR4和GPVI受体激动剂联合激活；使用CsA和质子载体羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理；数据以5秒间隔平均，采用Mann–Whitney U检验。

研究结果：

血小板坏死动态：联合刺激后，annexin V阴性（Ann V^?）血小板钙浓度迅速升高，30秒内达峰并维持约60秒后下降；新出现的annexin V阳性（Ann V⁺）血小板初始钙水平与Ann V^?峰值相当，随后继续升高并达平台。纤维蛋白原结合在Ann V^?持续增加，在Ann V⁺先快速增加后达平台。两种亚群在300秒内calcein信号变化不超过10–20%，提示质膜完整性保持。ROS在Ann V⁺初始较高后下降，在Ann V^?逐渐上升。前向散射（FSC）在Ann V⁺逐渐降至约静息值一半，侧向散射（SSC）在Ann V^?快速下降而在Ann V⁺缓慢下降，反映“球样化”和坏死泡形成。利用DiOC₆(3)和annexin V可将活化血小板分为活性的DiOC⁺AnnV^?、典型坏死的DiOC^?AnnV⁺和中间态DiOC⁺AnnV⁺，后者线粒体膜电位降低但质膜电位仍在，说明线粒体去极化早于质膜去极化。

坏死血小板的最终表型：激活15分钟后，坏死Ann V⁺血小板表现为持续高钙（RFR 2.46±0.64 vs 1.02±0.15）、FSC和SSC降低、DiOC₆(3)荧光几乎消失（2.01±0.18% vs 94.0±12.70%），表明线粒体和质膜均完全去极化；此时两组ROS水平相当。按calcein和annexin V可将血小板分为C⁺A^?（活）、C^?A⁺（典型坏死）和C⁺A⁺（质膜部分保留的坏死）。真正C^?A⁺亚群仅占1.93±1.29%，表明质膜完整性丧失明显慢于其他坏死过程。

线粒体在血小板坏死中的作用：mPTP抑制剂CsA（5 μM，15 min）完全抑制Ann V⁺形成；激活后加入CCCP则在CsA存在时诱导爆发性坏死（Ann V⁺达17.50±2.37%），而无CsA时为9.84±3.33%；若先加CCCP再激活，则无论有无CsA，促凝血血小板形成均被抑制（2.37±1.48% vs 1.56±0.65%）。CCCP还使静息血小板RFR显著升高（0.52±0.03 vs 0.41±0.02），但不改变激活时钙动员的峰值和曲线下面积。这表明CCCP可使线粒体释放钙，而激活前预先释放线粒体钙则消除触发坏死所需的条件。

讨论与结论：讨论部分指出，血小板坏死动态符合CypD依赖性mPTP开放模型：激动剂引起胞质钙升高，钙以电位依赖性方式进入线粒体；线粒体钙超载导致mPTP持续开放，释放钙进入胞质并引起线粒体膜电位丧失，同时伴随PS暴露和ROS产生。ROS在坏死早期升高，可能参与坏死过程，但需要进一步药理或遗传干预实验确认。CCCP在CsA存在时诱发爆发性坏死，是因为CsA阻断mPTP后钙被“困”在线粒体，加入质子载体促使钙快速释放；而激活前添加CCCP使钙预先释放，故随后激活不能诱发坏死。研究结论可翻译为：这些实验支持“电位依赖性钙通过线粒体钙单向转运体进入是正常激活过程中线粒体钙积累的主要机制”这一结论，并解释了此前报道的矛盾结果。考虑到促凝血血小板数量减少或增多均可能与病理后果相关，且CsA已是临床药物，这些发现具有潜在临床意义；但体外实验所需浓度可能超过临床使用浓度。