基于反向疫苗学策略开发针对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染的候选疫苗靶点筛选研究

《Brazilian Journal of Microbiology》：Reverse vaccinology for development of vaccine against Aeromonas hydrophila infection in nile tilapia (Oreochromis niloticus)

　　

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是罗非鱼的主要病原体之一，其表型多样，难以通过单一疫苗进行有效预防，目前主要依赖抗生素治疗。本研究旨在运用生物信息学工具，通过反向疫苗学（reverse vaccinology）策略，预测具有潜在保护效力的疫苗候选靶点，以保护尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）免受嗜水气单胞菌感染。研究人员在巴西伯南布哥州彼得罗利纳的圣弗朗西斯科河谷地区获取了35株嗜水气单胞菌基因组，并从GenBank数据库中获取了24株嗜水气单胞菌完整基因组及2个尼罗罗非鱼完整基因组。通过鉴定嗜水气单胞菌核心基因（core genes），并对尼罗罗非鱼基因组与嗜水气单胞菌基因组进行减法基因组学（subtractive genomics）分析，在178个候选蛋白中，有32个因在Vaxign工具中显示出高黏附概率（>0.51）而被视为潜在疫苗靶点。经与必需基因数据库（DEG）进行BLAST比对分析后，18个蛋白符合设定标准（e-value≤10?6），并与气单胞菌属（Aeromonas）致病菌种的蛋白具有显著相似性。基于黏附可及性、分子量介于19–80 kDa以及含0或1个跨膜螺旋等标准，最终筛选出10个蛋白。分析最终确定9个具有免疫学特性及新颖性的蛋白作为疫苗候选靶点，其中包括8个分泌蛋白（secreted）和1个可能表面暴露蛋白（PSE）。最后，仍需通过体外（in vitro）及体内（in vivo）实验对上述筛选结果进行实验验证。

论文解读

一、研究背景与问题

水产养殖在全球社会经济发展中具有重要地位，既是小规模生产者的重要收入来源，也是大型跨国企业的市场领域。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是全球水产养殖产量第三的物种，在巴西更是重要经济产品，2024年巴西尼罗罗非鱼产量达499,364,278公斤。然而，高密度养殖模式在带来经济效益的同时，也导致鱼类应激增加、生长性能下降，并显著提高了传染病暴发的风险。

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是鱼类细菌性传染病中最主要的病原体之一，给全球水产养殖业造成数百万美元的经济损失。该菌感染可表现出一系列外部症状，如鳞片脱落、尾部糜烂、皮肤发红和溃疡、眼球突出、眼睛混浊、腹部膨胀及游动异常，同时伴随腹腔充血、肝脏苍白、脾脏充血、肠道败血症及内脏器官肿大等内部症状。

目前，鱼类细菌性疾病主要依赖抗生素治疗。然而，抗生素的使用会将药物残留输入水体，若水体更新不当，可能导致鱼类体内抗生素残留，危及食品安全。即使在亚抑制浓度下，水体中的抗生素也可能诱导耐药性产生，包括人类肠道共生菌及鱼类和水生细菌，耐药基因可能在多种细菌群体中传播扩散。此外，地表水中抗生素的存在还对生物多样性、水生生物和鱼类免疫系统构成风险，可能改变鱼类微生物组，增加对病原体的易感性。

因此，亟需其他策略来减少细菌感染对经济、环境和公共健康的影响。疫苗作为一种预防病原体感染、减少抗生素使用的手段，受到越来越多的关注。1986年首个针对罗非鱼嗜水气单胞菌的全细胞单价疫苗问世，此后一些实验性疫苗在多种鱼类中显示出预防效果。然而，由于气单胞菌属（Aeromonas spp.）复合体存在多样的表型和血清学特异性，以及菌株间巨大的遗传变异和毒力基因复杂性，现有商业疫苗对异源菌株的保护效果受限，这一障碍至今仍然存在。

二、研究目的与意义

本研究旨在运用反向疫苗学（reverse vaccinology）策略，通过生物信息学手段，从全基因组水平预测能够保护尼罗罗非鱼免受嗜水气单胞菌感染的疫苗候选靶点。反向疫苗学通过分析细菌全基因组来筛选可能具有免疫原性的蛋白，可显著节省研究时间和经费。该研究为开发针对嗜水气单胞菌的特异性有效疫苗提供了起点，有望加速体外测试阶段并减少体内实验所需动物数量。

三、主要技术方法

研究人员从巴西圣弗朗西斯科河谷地区采集样本，获取了35株嗜水气单胞菌分离株，分别来源于健康尼罗罗非鱼肾脏（n=3）、患病尼罗罗非鱼（n=7）、患病皮拉拉拉鱼（Phractocephalus hemioliopterus）（n=1）、帕卡马鱼（Lophiosilurus alexandri）及枝角类水蚤（Dendrocephalus brasiliensis）混合样本（n=10）以及不同地点采集样本（n=14）。同时从GenBank获取24株嗜水气单胞菌完整基因组和2个尼罗罗非鱼完整基因组。

测序数据经FastQC质控、AdapterRemoval v.2去接头、KmerStream估计k-mer值后，采用SPAdes、Edena及Unicycler Assembly Pipeline进行基因组组装，CD-HIT去除重复序列，QUAST评估组装质量，Prokka v1.14.6进行基因注释。利用OrthoFinder软件进行核心基因组（core genome）鉴定和同源比对，通过BLASTp进行减法基因组学分析，筛选与宿主非同源的蛋白。SurfG+ v1.0软件预测蛋白亚细胞定位，DEG数据库（必需基因数据库）鉴定必需基因，Vaxign工具（含SPAAN和PSORTb）预测抗原性和黏附概率，SignalP 5.0预测信号肽，TMHMM 2.0预测跨膜螺旋数量，InterPro进行蛋白家族和结构域注释。

四、研究结果

基因组分析结果：OrthoFinder分析鉴定出2,823个属于嗜水气单胞菌核心基因组的基因，排除附属基因和单拷贝基因。在蛋白层面，332个嗜水气单胞菌蛋白与宿主尼罗罗非鱼非同源。

核心基因组鉴定、减法基因组学、蛋白亚细胞定位预测及必需基因鉴定结果：在332个属于核心基因组且与宿主非同源的蛋白中，178个被鉴定为可能表面暴露蛋白（PSE）、分泌蛋白或膜蛋白，154个被预测为胞质蛋白。胞质蛋白未纳入本研究，但可作为未来药物靶点研究的候选。

抗原特性预测与疫苗靶点筛选结果：178个PSE、分泌或膜蛋白中，32个被Vaxign认定为可能的免疫原性靶点（黏附概率>0.51）。其中18个在DEG数据库中被认定为必需蛋白。从18个必需蛋白中，依据Vaxign鉴定的最高黏附素概率选出10个蛋白。筛选标准包括跨膜螺旋数量（因跨膜螺旋过多的蛋白难以合成和纯化）、分子量等。WP_219313282.1、WP_113995956.1、WP_219312629.1、WP_029305116.1被分类为分泌和外膜蛋白，WP_043160143.1被分类为胞质膜和膜蛋白，其余5个被分类为未知和分泌蛋白。WP_043160143.1因无信号肽、分子量小于19 kDa且含4个跨膜螺旋而被排除。最终9个蛋白（WP_219313282.1、WP_219311764.1、WP_011705502.1、WP_219311898.1、WP_113995956.1、WP_219312142.1、WP_219312629.1、WP_029305116.1和WP_011707296.1）符合所有方法学标准，被选为疫苗候选靶点。

五、讨论与结论

讨论部分指出，位于膜上、PSE或分泌型蛋白最先接触宿主防御系统，因此更易产生适应性免疫应答。嗜水气单胞菌作为革兰氏阴性菌，其外膜蛋白更易暴露于胞外环境，有利于免疫识别。必需基因的鉴定是反向疫苗学的重要步骤，旨在识别在不同生物中保守且组成性表达的靶点，以提高诱导免疫应答的概率。

信号肽是通常长度为16–30个氨基酸残基的短肽，位于多数新合成蛋白的N端，引导蛋白进入分泌途径。在原核生物中，信号肽将新合成蛋白引导至质膜上的SecYEG蛋白通道，因此蛋白分泌效率很大程度上由信号肽决定。跨膜螺旋多次穿越外膜形成环状结构，暴露表位并与免疫系统接触，但过多的跨膜螺旋会限制体外蛋白合成效率，因此优先选择跨膜螺旋少的蛋白。分子量方面，100–600个氨基酸范围的蛋白相比更大或更小的蛋白更易获得可溶性表达产物。

在9个候选蛋白中，类胡萝卜素1,2-水合酶（WP_219313282）属于PF09410蛋白家族，具有脂质运载蛋白样折叠和杯状蛋白特征，可能参与细菌在氧化应激下的生存。金属-β-内酰胺酶（WP_219312142.1）属于MBL折叠金属水解酶家族，催化β-内酰胺环水解使抗菌药物失活。麦芽糖孔蛋白（WP_113995956.1）属于孔蛋白家族，限制多种抗菌药物进入革兰氏阴性菌胞质。YceI家族蛋白（WP_011705502.1）属于脂质运载蛋白超家族，可能参与脂肪酸螯合、抗生素抗性和多种应激反应。细胞色素c型生物发生蛋白CcmE（WP_219311898.1）和YtfJ家族蛋白（WP_011707296.1）分子量分别为42.90 kDa和19.61 kDa，均无跨膜螺旋，黏附概率分别为0.719和0.603。其中YceI家族蛋白、麦芽糖孔蛋白、维生素B12转运蛋白（WP_219312629.1）、裂解性转糖基酶（WP_219311764）和TonB依赖性铁载体受体（WP_029305116.1）经PBIT数据库验证为毒力因子，毒力因子与细菌致病性直接相关，其鉴定对开发有效疫苗至关重要。TonB依赖性受体在其他研究中已被证实是良好的疫苗靶点。

研究结论指出，通过反向疫苗学分析筛选出的9个蛋白被认为是潜在的疫苗靶点。该研究信息可为未来构建针对嗜水气单胞菌的疫苗研究提供支持和方向指导，可作为开发靶向有效疫苗的起点，加速体外测试并减少体内实验所需动物数量。然而，仍需通过实验验证来证明这些靶点的有效性，以及所开发疫苗的稳定性、安全性和免疫原性。