《Brazilian Journal of Microbiology》：Diagnostic performance of a loop-mediated isothermal amplification test for the diagnosis of human and cat sporotrichosis in two highly endemic areas in Brazil: insights from a real-world, field-based evaluation
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摘要专业翻译
孢子丝菌病是一种亚急性至慢性真菌病，在流行地区具有重大公共卫生意义，可感染人类和动物，尤其是猫。迫切需要快速且可及的诊断工具，以改善病例发现和疾病监测。因此，本研究旨在验证一种先前描述的环介导等温扩增（loop-mediated isotherm
摘要专业翻译
孢子丝菌病是一种亚急性至慢性真菌病，在流行地区具有重大公共卫生意义，可感染人类和动物，尤其是猫。迫切需要快速且可及的诊断工具，以改善病例发现和疾病监测。因此，本研究旨在验证一种先前描述的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）检测方法，用于诊断来自巴西两个高流行区的人源和猫源临床样本中的孢子丝菌病。研究人员开展了一项观察性研究，纳入疑似孢子丝菌病的人类患者和猫。首先使用Sporothrix属参考菌株评估分析灵敏度和分析特异性。随后在不同孵育时间下评估LAMP检测在临床样本中的诊断性能，并与培养结果进行比较。分别计算人源和猫源病例的灵敏度、特异性及其他诊断参数。LAMP检测能够检出与孢子丝菌病相关的三种主要Sporothrix物种，对巴西孢子丝菌（S. brasiliensis）具有更高的分析灵敏度。然而，当应用于人类临床样本时，该检测在较早孵育时间点表现出有限的灵敏度和特异性，导致总体诊断性能不佳。相比之下，猫源样本中的性能相对较高，但仍受假阳性和假阴性结果影响。尽管具有令人鼓舞的分析特性及先前在实验模型中的成功应用，该LAMP方案在真实世界临床条件下对人源和猫源孢子丝菌病的诊断实用性有限，凸显了在常规实践中推广应用前需进一步优化并进行严格的临床验证。
论文解读文章
一、研究背景与目的
孢子丝菌病是一种由Sporothrix属真菌引起的亚急性至慢性肉芽肿性真菌病，其中巴西孢子丝菌（Sporothrix brasiliensis）、球形孢子丝菌（Sporothrix globosa）和申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii）是全球最具临床相关性的物种。该病可感染人类和多种动物宿主，尤其是家猫在通过创伤性接种将真菌酵母菌传播至皮肤和皮下组织的人兽共患病传播中发挥核心作用。在巴西等流行地区，孢子丝菌病因发病率不断上升以及及时诊断和管理所面临的挑战，已成为突出的公共卫生问题。
传统诊断方法（包括人类和猫）高度依赖真菌培养和组织病理学评估，这些方法虽然特异性高，但本质上耗时且依赖专业实验室基础设施和技术人员。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）等分子方法虽已用于克服培养诊断的局限性，但通常需要昂贵设备、受控实验室环境和训练有素的人员，限制了其在资源有限环境或即时检测场景中的应用。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术因其高特异性、高灵敏度以及在等温条件下扩增靶核酸的能力，成为有吸引力的分子诊断替代方案，无需热循环仪，可通过简单比色变化观察结果，特别适合兽医诊所和实验室能力有限的机构。
尽管已有研究报道了针对Sporothrix的LAMP检测方法在菌株和实验样本中展现出良好的分析性能，但系统验证LAMP在不同临床样本类型中（涵盖人类和动物宿主）的性能仍有限，关于诊断准确性、可重复性和现场条件下的适用性的标准化数据匮乏。本研究旨在评估研究人员先前描述的LAMP方案在流行地区人类和动物临床样本中的诊断性能，探讨其能否作为支持这种被忽视真菌病检测和监测的稳健、快速、可及的诊断工具。
二、主要技术方法
研究人员在巴西两个高流行区开展了一项前瞻性观察性研究，纳入中心分别为里约热内卢的Evandro Chagas国家传染病研究所（INI/Fiocruz）和南里奥格兰德联邦大学（FURG）。人类患者在两个中心均纳入，猫仅在FURG纳入。研究采用培养阳性作为确诊孢子丝菌病的参考标准，病例定义依据EORTC/MSGERC标准并遵循STARD报告规范。主要技术方法包括：基于钙调蛋白（calmodulin, CAL）基因的LAMP引物设计，通过Python工作流进行引物架构的计算机模拟（in silico）评估；使用十株真菌DNA进行体外分析灵敏度和特异性评估；临床样本DNA提取后在不同孵育时间（30、40、50、60分钟）进行LAMP反应，以比色变化判定结果，并与培养结果比较计算灵敏度、特异性、似然比和诊断比值比（diagnostic odds ratio, DOR）。
三、研究结果
In silico和实验性LAMP引物性能评估
计算机模拟评估使用外部引物F3_SBRAZ和B3_SBRAZ鉴定出792条Sporothrix序列，其中419条与两个外部引物100%一致。在严格精确匹配条件下，所有八个引物结合区域在264/419条序列（63.0%）中被检出，其中243/419条（58.0%）在预测的F3–B3扩增子内保留完整架构。当允许每个引物结合区域最多一个核苷酸错配时，所有八个必需区域在全部419条序列（100%）中被检出，387/419条（92.4%）在扩增区间内保留完整架构。物种水平上，在≤1错配标准下，S. brasiliensis（256/256；100%）和S. schenckii（163/163；100%）的所有必需引物结合区域均被检出。实验验证表明，该LAMP检测可检出三种主要Sporothrix物种，对S. schenckii和S. globosa的检测限为200 pg/μL基因组DNA，对S. brasiliensis具有更高的分析灵敏度，检测限为20 pg/μL。其他无关真菌物种均呈阴性。
人类孢子丝菌病的LAMP诊断性能
两个中心共纳入76例人类患者，其中35例确诊孢子丝菌病，8例疑似，33例获得其他诊断。共分析76份临床标本，包括64份脓肿拭子和12份皮肤活检组织。LAMP结果在30和40分钟时仅1例确诊患者阳性；50分钟时4例阳性（2例确诊，2例非孢子丝菌病）；60分钟时33例阳性（18例确诊，3例疑似，12例非孢子丝菌病）。在人类样本中，LAMP在较早孵育时间灵敏度极低，即使在60分钟时也出现显著假阳性，总体诊断性能不佳。假阳性结果出现在结核病（n=2）和着色芽生菌病（n=2）病例中。培养确诊但LAMP阴性的患者涵盖了淋巴皮肤型、固定皮肤型和播散皮肤型三种主要临床表现。
不同临床样本类型的人类LAMP诊断性能
由于里约热内卢队列中无患者在60分钟前出现阳性，该分析仅在60分钟孵育时间进行。病变拭子的灵敏度（75%）略高于组织活检（67%），阳性似然比也略高（1.29 vs 1.00），但95%置信区间宽且重叠，表明两种样本类型无明确优劣差异。
猫孢子丝菌病的LAMP诊断性能
共评估90只猫，包括51例确诊孢子丝菌病，4例疑似，35例非孢子丝菌病。30分钟时21只猫阳性（全部确诊）；40分钟时30只阳性（28例确诊，2例非孢子丝菌病）；50分钟时33只阳性（30例确诊，3例非孢子丝菌病）；60分钟时41只阳性（33例确诊，2例疑似，6例非孢子丝菌病）。猫样本中，40分钟孵育时间获得最高DOR（22.52），表明该时间点提供了灵敏度和特异性之间的最佳平衡。
猫和人类群体中LAMP性能比较
在人类30和40分钟及猫30分钟时间点，未观察到假阳性，特异性达100%，阳性似然比数学上无法定义。其余时间点，猫的阳性似然比始终高于人类，表明该检测在猫群体中具有更强的纳入诊断能力。人类样本在50和60分钟孵育后的低DOR反映了检测区分孢子丝菌病和非孢子丝菌病病例的能力有限。
四、讨论与结论
本研究的核心发现是，尽管该LAMP方案在实验室条件下和分析层面表现良好，但在真实世界临床条件下对人类孢子丝菌病的诊断价值有限，对猫孢子丝菌病仅表现出中等性能。人类样本中诊断性能不佳的可能因素包括：真菌载量低、病变内真菌分布不均、宿主或微生物来源的抑制剂干扰扩增、钙调蛋白作为单拷贝基因的低拷贝数、样本采集质量差异以及不同中心间S. brasiliensis菌株的遗传差异。假阳性结果尤其在较长孵育时间出现，涉及结核病和着色芽生菌病病例，提示非特异性扩增或交叉反应，以及比色LAMP检测在超出最佳时间点后易受晚期非特异性反应和pH变化影响。
猫样本性能相对较好，归因于猫孢子丝菌病病变通常具有高真菌载量和广泛组织受累的生物学特征。研究还发现，两个中心间在60分钟孵育后的灵敏度存在显著差异，引发对检测可重复性和外部有效性的关注。研究人员指出，实验模型中的受控条件与真实临床样本的异质性之间存在本质差异，强调了多中心验证研究的重要性。
研究结论认为，该LAMP方案目前的形式不足以可靠支持流行地区人类孢子丝菌病的诊断，对猫孢子丝菌病的诊断性能也仅为中等，最佳孵育时间不超过40分钟。未来改进方向可能包括优化DNA提取方法、改进引物设计、改用荧光检测方式或与其他诊断方法联合使用。本研究凸显了严格临床验证和透明报告局限性的价值，这是负责任地开发被忽视真菌病即时检测工具的关键步骤。
