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环境DNA（eDNA）宏条形码（metabarcoding）是评估水生生物多样性以及渔业和水产养殖可持续性与影响的有力监测工具。然而，常规实验室工作流程仍然耗时且依赖专用基础设施。在此，研究人员展示了一种完全便携式、离场（off-site）eDNA宏条形码流程
环境DNA（eDNA）宏条形码（metabarcoding）是评估水生生物多样性以及渔业和水产养殖可持续性与影响的有力监测工具。然而，常规实验室工作流程仍然耗时且依赖专用基础设施。在此，研究人员展示了一种完全便携式、离场（off-site）eDNA宏条形码流程的现场试验，该流程可在数天内使用紧凑设备完成端到端分析，包括BentoLab工作站和Oxford Nanopore Technologies（ONT）MinION测序仪。该工作流程在挪威和巴西的两个国际培训课程中实施，学生和早期职业研究人员在现场采集环境样本、提取和扩增DNA、制备DNA文库并在现场测序，随后进行生物信息学和统计分析。在此详述的案例研究中，在Oslofjord现场采集和分析的7份eDNA样本可检测到16种鱼类和板鳃类（elasmobranch）物种。尽管总体多样性低于先前使用Illumina测序的研究，但该方案可靠地检测到关键物种，并证明便携式eDNA宏条形码用于快速生态评估、高风险区域监测和/或在偏远或资源有限环境中部署是可行的。
人为活动（栖息地退化、污染和气候变化）驱动物种灭绝和全球生物多样性丧失。水生生态系统受捕捞渔业和水产养殖强烈压力；这些产业对生计和经济重要，却带来生态退化、病原体和寄生虫传播、野生鱼类种群下降等生态成本，水产养殖集约化还促进富营养化、有害藻华和疾病相关死亡。培训下一代科学家对监测和缓解这些影响、促进可持续性至关重要。环境DNA（eDNA）宏条形码（metabarcoding）可评估生态系统和渔业健康；eDNA采样较简单，但样本处理和数据分析需专门培训与设施、耗时且输出延迟。现场处理可在数小时或数天内出结果，支持近实时物种检测和自适应采样；采样后尽快提取DNA可减少降解并缓解偏远地区运输和保存问题；现场协议还可用于常规生态健康评估和生物监测。然而，实验室外完成全流程存在物流和技术挑战，极端温度、强风和降雨可影响样本完整性和人员表现，需要周密规划。研究人员因此提出涵盖从采样到最终结果的可靠离场宏条形码协议。
两个国际培训课程在巴西Bragan?a和挪威Dr?bak举办，学生和早期职业研究人员在混合小组中使用便携实验室设备和Oxford Nanopore Technologies（ONT）MinION测序仪，接受采样策略、DNA提取与扩增、基础生物信息学和统计分析及数据管理培训。案例研究在Oslofjord的Dr?bak和Dr?bak水族馆于2025年11月3—4日采集7份eDNA样本（Oslofjord 6份、水族馆展示缸1份），现场完成DNA提取、两套引物PCR、文库制备和MinION测序，随后离场生物信息处理生成操作分类单元（OTU）表和分类分配，并用自定义R脚本质控、分析和绘图。作者结论是：完全便携的离场eDNA宏条形码流程可在数天内用紧凑设备完成端到端分析；案例可靠检测关键物种；尽管总体多样性低于基于Illumina测序的既往研究，该方案证明便携式eDNA宏条形码用于快速生态评估、高风险区域监测和/或偏远或资源有限环境部署可行。其意义在于支持快速现场诊断和环境评估，并可能为环境机构或渔业部门决策者提供关键信息；开放数据和协议支持复现、教学和其他研究问题。
关键技术方法：样本来源于2025年11月3—4日挪威Oslofjord Dr?bak的6份环境水样和Dr?bak水族馆展示缸1份水样，共7份，由国际培训课程参与者现场采集；水样过滤体积750—2500 ml。现场用BentoLab Pro v1.4完成DNA提取与聚合酶链反应（PCR）；以Riaz和Teleo2引物扩增线粒体12S rRNA短片段，采用索引引物和ONT barcodes，每样本4个PCR重复，并设提取和PCR对照。文库制备按修改的SQK-NBD114-24方案，在FLO-MIN114流动池用MinION测序。生物信息学用cutadapt拆样、VSEARCH质控/去冗余/97% identity聚类OTU/去嵌合，以SINTAX和usearch_global比对MIDORI2数据库完成分类分配；R v4.5.1用于统计分析和可视化，数据按FAIR原则和GBIF指南管理。
结果与讨论（Results and discussion）
测序产出与OTU构建：MinION运行18 h 40 min，产生13.43 M reads和约8.04 Gb called bases；Barcode01—04分别有3.0 M、2.7 M、2.3 M和3.1 M reads通过basecalling质量阈值。经宏条形码处理和过滤，获得543 392条raw reads、173个unique OTUs；阴性对照最大51 reads（Riaz，Eopsetta grigorjewi）和35 reads（Teleo2，P. virens）从其他样本同OTU中扣除。进一步质控、去污染、保留鱼类和板鳃类、手工校正分类错误并合并同物种OTU后，得到280 826条reads，代表26种鱼类和板鳃类；摘要报告现场分析检测到16种，结果部分最终汇总为26种。
分类学校正：回收48个unique鱼类和板鳃类OTUs，其中9个OTUs在合并前被校正；这些OTUs初由MIDORI2 assigned to six species，但因Artsdatabanken和GBIF（Global Biodiversity Information Facility）中无Oslofjord occurrence records被判为false positives；BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）比对NCBI显示与5个近缘种相似性≥99%，高于原MIDORI2分配（56—96%）。校正包括Anguilla japonica→Anguilla anguilla、两个Dipturus batis和一个Raja asterias→R. clavata、三个E. grigorjewi→H. hippoglossus、Gadus chalcogrammus→Gadus morhua、Myoxocephalus aenaeus→Myoxocephalus scorpius。原文认为假阳性可能源于短amplicon长度（127—188 bp）对12S分辨率不足、SINTAX基于k-mer自动分配最相似分类，以及污染可能；本研究未采集field blank。
群落组成与引物比较：基于presence-absence数据，两套引物检测的群落组成不同，Teleo2多检测11种，Riaz无独有物种。水族馆展示缸物种清单中的8种鱼均在水族馆样本（positive control）和Oslofjord环境样本中鉴定；positive control还检测到12种与Oslofjord相同的鱼，原文认为可能反映continuous intake of seawater from the Oslofjord；Oslofjord环境样本另有6种未在水族馆样本中检测。两采样日期群落无显著差异。
与既往调查比较：与同季节Oslofjord既往eDNA调查相比，本研究检测到5种未在其他研究中出现的物种：Anarhichas denticulatus、A. lupus、H. hippoglossus、R. clavata和S. canicula，且在水族馆positive control和Oslofjord环境样本中均检测到；既往使用MiFish和Elas02引物未检测到这5种，提示引物选择对特定类群检测有显著影响。与既往Oslofjord eDNA调查相比，本研究仅恢复部分鱼类多样性（既往51—65种，本研究26种）；原文认为差异可能反映有限样本、单点短时间采样、低过滤水量和无自然重复导致假阴性，以及Illumina MiSeq与ONT MinION测序错误率差异和严格过滤可能过度过滤raw reads并丢失真检测。
现场工作流可行性：研究人员在远离洁净实验室的现场完成采样、DNA提取、扩增、文库制备、测序和数据处理，并在5天内完成全流程；设备潜在可由电池运行，但未研究离网设置。BentoLab、DIYNAFLUOR（3D打印DNA荧光计）和MinION以及可在无互联网标准笔记本上运行的生物信息流程提高可行性；协议有潜力适配电池、便携冷却器、太阳能/发电机充电和远程前哨，?20 °C试剂可干冰短途运输，长途可能需冻干等适应。参与者能在课程期间完成全流程。
讨论部分总结：Carvalho et al.、Kvalheim et al.和Mahlangu et al.的既往Oslofjord调查显示更高多样性；本研究多样性较低，原文归因于采样设计有限、单点短时间、低过滤水量、无自然重复、MinION错误率较高和严格过滤可能过度过滤；同时强调引物选择和参考数据库覆盖影响结果，建议可能时采用多标记方法。现场流程在5天内完成，设备潜在电池运行但离网未验证；?20 °C试剂可干冰短途运输，长途需冻干等适应。尽管有局限，参与者在课程期间完成全流程，表明在关键环节得到控制时，现场宏条形码可在短时间内回答广泛研究问题。
研究结论（翻译）：研究人员提供了一种在远离洁净实验室和高性能计算机的现场开展eDNA宏条形码的实用且可行的方法。该方法可容易修改以适用于其他引物对和基因区域。研究人员提供的生物信息学代码可跨笔记本电脑平台移植，也可容易修改以满足特定需求并整合额外生物信息学步骤。这种实用方法对研究人员有益，因为它能够实现快速现场诊断和环境评估，并有可能为环境机构或渔业部门的决策者提供关键信息。所提供的开放获取数据和协议可复现整个工作流程，进一步支持其在其他教学课程中的使用，并作为研究多样科学问题的基础。
