青海牦牛源BVDV 1u E2糖蛋白截短抗原：面向血清学监测与亚单位疫苗开发及牦牛中和抗体评价

《Transboundary and Emerging Diseases》：E2 Glycoprotein of BVDV 1u Circulating in Qinghai Yaks: A Candidate for Serological Surveillance and Subunit-Vaccine Development With Neutralizing-Antibody Evaluation in Yaks

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）呈全球分布，严重危害养牛业；Pestivirus bovis（原BVDV-1）亚基因型1u是中国青海牦牛群中流行的优势亚型。本研究旨在表达牦牛源BVDV 1u E2糖蛋白N端片段（氨基酸1–200），并鉴定其抗原性和免疫原性，以用于血清学监测和亚单位疫苗开发。研究人员利用纯化的截短E2抗原建立间接酶联免疫吸附试验（ELISA），用于检测牦牛血清中BVDV特异性抗体。采用弗氏佐剂和Montanide ISA 201 VG在BALB/c小鼠中评价重组蛋白的免疫原性，测定CD4⁺/CD8⁺ T细胞活化及干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）分泌。进一步在BVDV未感染牦牛犊中进行免疫，以评估BVDV 1u特异性中和抗体应答。所建立的间接ELISA诊断敏感性为99.0 %、特异性为97.4 %，与其它常见牛病原无交叉反应；筛查377份田间牦牛血清样本，BVDV血清流行率为21.48 %。两种佐剂均在小鼠中诱导高水平抗体，但Montanide ISA 201 VG诱导更强的T细胞活化和促炎细胞因子产生。在免疫牦牛犊中，E2-ISA 201疫苗抗原诱导的BVDV 1u特异性中和抗体滴度与商业灭活疫苗诱导的抗体滴度呈相似趋势。研究结果表明，截短BVDV 1u E2可作为血清学监测的可行抗原和BVDV候选亚单位疫苗开发抗原。本研究为中国牦牛养殖区区域BVDV防控提供了可靠实验证据。

牛病毒性腹泻病毒（BVDV，引起牛及牦牛等反刍动物感染并造成繁殖障碍和消化道等疾病）呈全球分布，被世界动物卫生组织列为通报疫病，在中国被列为三类动物疫病；其可感染多种家养和野生反刍动物，并可经胎盘感染胎儿，产生持续感染（PI）犊牛，给养牛业造成长期经济损失。BVDV基因组约12.3 kb，为单股正链RNA，含5′-UTR（5′非翻译区）、一个开放阅读框和3′-UTR；开放阅读框编码多聚蛋白，经加工形成C/Erns/E0/E2结构蛋白及Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B非结构蛋白。按细胞病变特征分为非致细胞病变型（NCP）和致细胞病变型（CP）；按种分为BVDV-1（Pestivirus bovis）、BVDV-2（Pestivirus tauri）及HoBi-like Pestivirus（历史称BVDV-3，Pestivirus brazilense），并可进一步分为多个亚基因型。中国拥有全球主要牦牛资源，青海为最大牦牛养殖区；研究人员近期监测确认BVDV 1u为当地牦牛优势亚型。E2为BVDV囊膜表面糖蛋白，主要介导病毒吸附和侵入宿主细胞，并可诱导特异性中和抗体，具较强免疫原性；其抗原结构域高度保守，可降低抗原–抗体反应交叉性。既往研究多集中于全长BVDV E2的免疫评价，而BVDV 1u截短E2在牦牛犊中的免疫应答研究较少。因此，研究人员对青海牦牛优势亚型BVDV 1u E2进行生物信息学分析，构建原核表达载体表达截短蛋白，建立基于E2抗原的间接ELISA用于BVDV血清学监测，并在小鼠和牦牛中评价其免疫原性，为BVDV诊断试剂和亚单位疫苗研发提供理论基础。

主要技术方法：研究人员以生物信息学筛选E2 N端1–200 aa，构建pET-28a-E2并原核表达、纯化；以纯化抗原建立间接ELISA，用463份已知BVDV抗体状态牦牛血清确定cutoff，并以青海不同地区377份田间牦牛血清进行临床评价；BALB/c小鼠（购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心）比较E2-FA与E2-201免疫原性；15头2–4月龄BVDV阴性牦牛犊（青海中惠农牧科技有限公司）随机分为5组（n=3），三免后以MDBK（牛肾细胞）细胞病毒中和试验（VNT）检测BVDV 1u中和抗体。

3.1 E2蛋白的生物信息学分析：通过ProtParam、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA和SWISS-MODEL分析，E2全长374 aa，分子量42.25 kDa，等电点6.11，GRAVY为?0.300，为亲水蛋白；346–368位存在跨膜区，无信号肽；二级结构以无规卷曲为主（58.29 %），α螺旋13.37 %，延伸链28.34 %；N端1–200 aa亲水性好、无跨膜区和信号肽、折叠性能好且含多个B细胞表位，故被选为血清学诊断标志，并构建pET-28a-E2重组质粒。

3.2 重组E2蛋白的表达、纯化与鉴定：通过双酶切、Sanger测序、SDS-PAGE和Western blot，重组质粒构建正确；重组E2蛋白约28 kDa，主要以包涵体形式存在于菌体沉淀，经6 mol/L尿素变性及亲和柱纯化获得目标蛋白；BVDV阳性牦牛血清可识别该蛋白，表明截短BVDV 1u E2具良好免疫原性。

3.3 BVDV抗体检测间接ELISA的建立与临床应用：通过棋盘滴定优化抗原包被浓度23.60 μg/mL、血清稀释1:20、PBST封闭、HRP标记二抗1:20000、血清和二抗均37℃孵育30 min；基于199份阳性和264份阴性血清的ROC（受试者工作特征曲线）分析，AUC（曲线下面积）为0.99，cutoff为PP（阳性百分比）64.56 %，诊断敏感性99.00 %、特异性97.40 %；分析敏感性最高达1:800；与牛轮状病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、多杀性巴氏杆菌、牛分枝杆菌和口蹄疫病毒阳性血清无交叉反应；批内和批间CV（变异系数）均低于10.00 %；377份青海田间牦牛血清中81份阳性，总体血清流行率21.48 %，提示当地牦牛群BVDV感染较普遍。

3.4 E2蛋白多克隆抗体的特异性鉴定：通过小鼠三免后血清间接ELISA，E2-FA和E2-201组抗体灵敏度均达1:256000；Western blot显示两组多克隆抗体均与纯化E2蛋白特异性结合；免疫荧光显示E2-FA和E2-201多克隆抗体均可与BVDV 1u感染的MDBK细胞反应，而与阴性血清对照相比呈绿色荧光，表明抗体对BVDV 1u感染细胞具良好反应性。

3.5 E2-201较E2-FA促进更强的细胞免疫和细胞因子应答：通过流式细胞术检测脾脏CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞比例，两种佐剂免疫组均显著升高，且E2-201组显著高于E2-FA组；通过ELISA检测血清细胞因子，两组TNF-α、IFN-γ和IL-6均升高，E2-201组显著高于E2-FA组，表明Montanide ISA 201 VG可诱导更强细胞免疫和促炎细胞因子应答。

3.6 重组E2抗原在牦牛犊中诱导BVDV 1u特异性中和抗体应答：通过MDBK细胞VNT检测，PBS组三头牦牛犊中和抗体滴度均<1:4；E2-ISA 201组滴度分别为1:512、1:256和1:512；三种商业灭活疫苗组滴度在1:64–1:512之间且组内变异明显；表明重组BVDV 1u E2抗原可在牦牛犊中诱导高水平BVDV 1u特异性中和抗体，其应答趋势与商业灭活疫苗相似。

讨论部分总结：BVDV全球流行并造成养牛业重大经济损失；低流行区多采用监测和扑杀，高流行区以疫苗免疫为核心，因此开发安全有效的基因工程疫苗十分重要。E2作为BVDV主要结构抗原，具有优势抗原决定簇、介导病毒吸附入侵并诱导中和抗体，较E0和E1更适合作为诊断抗原和亚单位疫苗候选。本研究基于青海牦牛优势BVDV 1u的E2生物信息学分析，选择N端1–200 aa进行原核表达；重组蛋白虽主要形成包涵体，但表达效率高且具良好免疫原性，满足血清学诊断和免疫原性评价需求。所建间接ELISA cutoff可靠、敏感性高、特异性好、重复性稳定，且与其他常见牛病原无交叉反应，适用于牦牛群BVDV大规模血清学筛查；青海牦牛抗体阳性率达21.48 %，提示应加强系统流行病学监测和针对性防控。小鼠免疫显示E2-FA和E2-201均诱导体液免疫，抗体水平达1:256000，并均提高脾脏CD4⁺、CD8⁺ T细胞比例和细胞因子分泌；E2-201组细胞免疫和细胞因子应答更强，可能与弗氏佐剂油相不可代谢、易致局部不良反应及免疫激活过度等有关，而Montanide ISA 201 VG免疫应答更平衡温和、副作用较少、组织相容性和体内代谢性较好。牦牛犊试验中E2-ISA 201诱导BVDV 1u特异性中和抗体，最高达1:512，趋势与商业灭活疫苗相似，但商业疫苗组组内变异较大且每组样本量小（n=3），限制统计比较。研究局限包括：截短E2可能丢失部分构象表位；未进行病毒攻毒和长期免疫持久性评价；仅检测BVDV 1u中和抗体，未检测BVDV-1a、BVDV-2和BVDV-3等交叉中和。后续需采用CHO、HEK293等真核表达系统制备天然样E2，开展大规模动物试验、攻毒试验和跨基因型中和试验。

研究结论翻译：本研究成功表达青海牦牛流行BVDV 1u的N端截短E2片段（氨基酸1–200），其保留良好免疫原性；建立了BVDV抗体检测间接ELISA，具有高敏感性/特异性、可接受重复性和可忽略交叉反应。小鼠免疫验证重组E2诱导体液和细胞免疫；与弗氏佐剂相比，Montanide ISA 201可诱导更强T细胞和促炎细胞因子应答。在BVDV未感染牦牛犊中，E2-ISA 201诱导BVDV 1u特异性中和抗体滴度，趋势与商业灭活疫苗相似。仍需进一步大规模动物试验、病毒攻毒试验和跨基因型中和试验以明确其保护能力和交叉反应潜力，为牦牛养殖区针对性BVDV疫情防控提供实验证据。