基于环境DNA（eDNA）监测害虫抗药性突变：以甘蓝茎跳甲拟除虫菊酯抗性为例

《Pest Management Science》：Environmental DNA is an efficient tool for monitoring pesticide resistance mutations in pest insects

　　

环境DNA（eDNA）宏条形码技术是监测生物多样性的革命性工具。此外，在单物种检测中，eDNA还可用于检测核基因组突变的存在及其频率。在农业系统中，这可为检测并估算害虫节肢动物中农药抗性突变的相对频率提供强大工具，从而实现更具靶向性的抗性管理。本研究测试了利用eDNA检测甘蓝茎跳甲（CSFB；Psylliodes chrysocephala）中赋予拟除虫菊酯抗性的电压门控钠通道（VGSC）突变的存在与频率的可能性。研究人员首先通过实验室实验检验了eDNA检测突变的效率：让携带已知抗性突变的甲虫与白菜（Brassica rapa）叶片相互作用。随后，研究人员通过两项田间实验验证该方法。首先，采集油菜（Brassica napus）叶片和单个甲虫，比较从eDNA与传统标本基因分型获得的SNP相对频率。其次，利用先前采集自多个田地的油菜茎秆批量样本，探究抗性突变的流行程度。研究表明，植物源eDNA能够提供与单个甲虫基因分型相当的抗性突变存在性与频率信息。本研究表明，eDNA是农业中高效且可扩展的农药抗性监测工具，为未来基于eDNA的抗性检测研究奠定了基础，并推动了精准农业的发展。

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研究背景与科学问题

农药抗性是全球农业面临的严峻挑战。随着拟除虫菊酯类杀虫剂的广泛使用，许多害虫已演化出靶标位点抗性，其中电压门控钠通道（VGSC）的突变是主要机制之一。传统的抗性监测依赖大量采集害虫个体进行基因分型，这种方法耗时费力且难以规模化。环境DNA（eDNA）宏条形码技术虽已被成功用于监测群落多样性，但其能否应用于定量检测单一物种内的功能基因突变（如抗药性等位基因频率）尚不清楚。针对这一空白，本研究以欧洲油菜重要害虫——甘蓝茎跳甲（CSFB；Psylliodes chrysocephala）为模型，系统评估了植物源eDNA在检测和量化VGSC中s-kdr（超级击倒抗性）突变（如M918L、L925I、T929N）方面的可行性。

研究设计与核心发现

研究人员通过三个递进式实验验证假设：（1）实验室控制实验，将已知基因型的英国株系（含L925I）和法国株系（含M918L）混合后置于白菜叶上，比较叶片eDNA与个体甲虫的基因型；（2）2025年2月在卢森堡Oberkorn田间采集120片单叶和60头幼虫，对比eDNA与标本基因分型结果；（3）对2024年春季采集自卢森堡三个油菜田（Kehmen、Oberkorn、Reuler）的批量茎秆样本进行回溯性检测。结果表明：eDNA检测到的抗性突变相对丰度与个体甲虫数据高度一致（实验室实验中R2=0.97，P<0.01），但当突变频率低于约10%时，单个eDNA样本可能漏检。在田间实验中，Oberkorn地区eDNA估算的M918L频率为55.72%，而个体甲虫中该突变携带率为76.47%，两者趋势一致。批量茎秆样本进一步显示，M918L在卢森堡三个田块中普遍存在（相对丰度57.61%~88.56%），表明拟除虫菊酯在该地区的有效性可能已严重受限。

关键技术方法

研究人员采用以下核心技术路线：

1. 1.
   样本来源：实验室阶段使用英国诺里奇和法国Boissay两个已知抗性基因型的CSFB品系；田间样本来自卢森堡Oberkorn（2025年2月）及Kehmen、Oberkorn、Reuler三地（2024年春季）。
2. 2.
   eDNA获取：叶片样本经蒸馏水振荡洗涤后，通过0.45 μm硝酸纤维素滤膜真空过滤富集DNA。
3. 3.
   靶标扩增：设计特异性引物（REF918_fw/sKDR R和sKDR F/sKDR R）扩增VGSC基因中包含M918、L925、T929位点的199 bp或160 bp片段。
4. 4.
   高通量测序与生物信息学：采用Illumina MiSeq平台双端测序，经PEAR合并、USEARCH去冗余并聚类为零半径操作分类单元（zOTUs），通过BLASTn比对和蛋白质序列翻译确认突变类型。
5. 5.
   统计分析：以相对读长丰度作为等位基因频率的代理指标，使用线性模型评估eDNA与标本数据的相关性。

研究结果详述

3.1 实验室实验

95只甲虫成功测序（≥50 reads），其中无s-kdr突变的野生型占86.84%，L925I占7.63%，M918L占5.53%。15份叶片eDNA样本（≥1000 reads）中，野生型相对丰度为95.08%，L925I为0.89%，M918L为4.03%。线性回归显示eDNA频率与甲虫真实频率显著相关（R2=0.97，P<0.01），但突变频率低于10%时单一样本易漏检。

3.2 田间实验

Oberkorn的24份有效叶片eDNA样本中，M918L相对丰度为55.72%，检出率95.83%；同期采集的51头幼虫中M918L携带率82.35%（纯合子70.6%）。批量茎秆样本分析显示，M918L在Kehmen、Oberkorn、Reuler的相对丰度分别为61.18%、88.56%和57.61%，且在Oberkorn所有有效样本中均同时检测到野生型和M918L。

3.3 测序深度分析

稀有曲线表明，当前设定的eDNA测序深度（20000 reads）足以区分两种单倍型，但对杂合个体标本需提高测序阈值。

讨论与结论

讨论部分指出，eDNA能有效检测并近似量化抗性突变频率，但稀有突变（<10%）的随机扩增可能导致漏检，因此需依赖重复样本或大体积批量样本。研究中部分叶片样本扩增成功率低，可能源于冬季甲虫活性下降导致的eDNA稀释，或不同采样/提取方案的影响。值得注意的是，卢森堡CSFB种群中M918L的高频存在（57%~89%）与邻近法德两国的报道一致，表明拟除虫菊酯在该地区的防治效果可能已大幅下降。

结论部分（原文翻译）：本研究表明，利用eDNA分析检测昆虫抗药性的靶标位点突变并估算其在害虫种群中的相对频率是可行的。这使得该技术成为分析靶标抗性时空演化的潜在诊断工具，即使在没有害虫标本的情况下也能应用。这将为未来对其他具有相似抗性机制的生物进行优化监测铺平道路。