表达S1抗原的鼻内免疫策略可赋予小鼠对SARS-CoV-2鼻内攻毒的功能性无菌保护

《Vaccine》：Intranasal immunization expressing S1 antigen can confer functionally sterile protection against an intranasal SARS-CoV-2 challenge in mice

　　

目前获批的COVID-19疫苗已显示出对SARS-CoV-2感染后疾病发生和进展的显著保护效力。然而，肌肉注射疫苗诱导的全身免疫反应对病毒传播的保护作用有限。鼻内免疫是诱导黏膜免疫反应以保护病毒传播的重要策略。在此，研究人员探究了表达SARS-CoV-2刺突（S）抗原的鼻内免疫在小鼠模型中预防SARS-CoV-2感染的潜力。使用表达与T4纤维蛋白三聚化结构域融合的SARS-CoV-2 S1结构域的仙台病毒（SeV）载体进行鼻内免疫，在BALB/c小鼠中不仅诱导了血浆中、还诱导了支气管肺泡灌洗液（BALF）中的中和抗体（NAb）。在用人适应SARS-CoV-2株QHmusX进行鼻内攻毒后，所有未免疫小鼠（n=9）均出现显著体重下降和BALF中高病毒载量。相比之下，鼻内免疫小鼠（n=8）的BALF中未检测到病毒亚基因组RNA（sgRNA）或感染性病毒，仅有一只小鼠具有边缘水平的sgRNA，且未表现出体重下降。该研究表明，表达S1抗原的鼻内免疫可针对SARS-CoV-2感染提供功能性无菌保护。

研究背景方面，COVID-19大流行对全球健康和社会活动造成巨大冲击。现有获批的COVID-19疫苗，如mRNA疫苗，能够有效降低SARS-CoV-2感染后的重症率和死亡率，但其诱导的全身性免疫应答对阻断病毒传播作用有限，且变异株对疫苗诱导的中和抗体产生抗性。由于无症状感染者难以被识别和控制，SARS-CoV-2持续传播的风险很高，亟需能够预防传播的疫苗策略。黏膜免疫在呼吸道病毒传播控制中具有核心作用，但传统肌肉注射疫苗难以有效诱导黏膜免疫。仙台病毒（SeV）载体此前已被证明可经鼻内免疫诱导黏膜T细胞应答并在动物模型中提供一定保护，但其能否诱导呼吸道黏膜抗体应答、以及该应答能否提供针对SARS-CoV-2感染的保护，此前尚不明确。为此，研究人员构建了表达SARS-CoV-2刺突（S）抗原的SeV载体，并在小鼠模型中系统评估了鼻内免疫诱导的黏膜抗体、中和抗体和T细胞应答及其对SARS-CoV-2攻毒的保护效果。

研究人员开展了以下主要实验：构建了表达嵌合抗原S1-fol的复制缺陷型F基因缺失SeV载体（SeV-S1-fol），该抗原由SARS-CoV-2（武汉祖先株wk-521）的S1亚基与T4纤维蛋白三聚化结构域（foldon）融合而成。动物实验采用BALB/c小鼠，通过皮下或鼻内途径给予低或高剂量SeV-S1-fol一次或两次（间隔5周），并采集血浆、支气管肺泡灌洗液（BALF）和宫颈淋巴结。采用ELISA检测抗S IgG和IgA抗体，采用活病毒中和试验及S假型水疱性口炎病毒（VSV）中和试验评估中和抗体（NAb）水平和交叉反应性，采用流式细胞术检测S特异性CD8⁺ T细胞。随后，对高剂量两次鼻内免疫小鼠及未免疫对照小鼠以2 LD₅₀小鼠适应SARS-CoV-2株QHmusX进行鼻内攻毒，比较两组体重变化、存活率，并在攻毒后第3天检测肺和BALF中亚基因组RNA（sgRNA）、BALF感染性病毒滴度及肺组织病毒抗原阳性细胞；部分小鼠观察至攻毒后第10天，比较攻毒前后免疫应答变化。

研究结果部分如下：在2.1小节中，研究人员通过Western blot分析确认SeV-S1-fol感染细胞可表达S1抗原，且大部分抗原形成三聚体，说明S1-fol设计能够实现三聚化，为后续免疫实验奠定基础。在2.2小节中，ELISA结果显示，鼻内免疫可剂量依赖地诱导血浆抗S IgG应答，第二次免疫能显著增强该应答；而皮下免疫仅诱导边缘水平血浆抗体。在BALF中，鼻内免疫可同时诱导抗S IgG和IgA，皮下免疫则几乎不能诱导IgA。在2.3小节中，活病毒中和试验显示，第二次高剂量鼻内免疫可高效诱导血浆NAb，而皮下免疫不能有效诱导；S假型VSV中和试验进一步显示，血浆NAb对Delta变异株具有中和活性，但对Omicron（BA.1和BA.2）变异株的中和活性较低且仅部分小鼠可检出。此外，BALF中也检测到NAb诱导。流式细胞术分析表明，鼻内免疫可在宫颈淋巴结中有效诱导S特异性CD8⁺ T细胞，而皮下免疫诱导效果较差。在2.4小节中，攻毒实验中未免疫对照小鼠体重急剧下降，9只中7只于攻毒后第5天因体重下降超过25%被实施安乐死；相比之下，所有SeV-S1-fol鼻内免疫小鼠均未出现显著体重下降，生存率显著提高。攻毒后第3天，未免疫小鼠肺和BALF中sgRNA水平及BALF感染性病毒滴度均显著高于免疫组；免疫组中除一只小鼠存在边缘水平sgRNA外，其余小鼠肺和BALF中sgRNA均不可检测，且BALF中均未分离到感染性病毒，肺组织中病毒抗原阳性细胞极少或不可见，表明黏膜免疫应答可在功能上实现无菌保护。在2.5小节中，攻毒后第10天，存活的未免疫对照小鼠血浆中可检测到NAb和S特异性CD8⁺ T细胞应答；而免疫小鼠的NAb滴度与攻毒前无显著差异，S特异性CD8⁺ T细胞频率反而低于攻毒前，提示攻毒后未发生病毒复制介导的免疫增强，进一步支持免疫小鼠体内已完全阻断病毒感染。

讨论部分指出，黏膜免疫在呼吸道病毒保护中起主导作用，现有肌肉注射疫苗无法有效诱导黏膜免疫，难以实现无菌保护。该研究证明鼻内SeV-S1-fol免疫可同时诱导血浆和BALF中的NAb，且BALF中IgA水平与中和活性相关，提示黏膜IgA可能在局部中和中发挥重要作用。但血浆抗体对SARS-CoV-2变异株的交叉中和能力有限，黏膜抗体的交叉反应性仍需进一步研究。此外，鼻内免疫诱导的持久性记忆B细胞和浆细胞可能维持较长期保护，其具体贡献有待阐明。考虑到全球大量人群已通过疫苗接种或自然感染获得对SARS-CoV-2的免疫，未来需评估鼻内黏膜疫苗在预先免疫人群中的加强效果。研究结论可以概括为：鼻内SeV-S1-fol免疫能够有效诱导黏膜NAb应答，赋予小鼠对SARS-CoV-2鼻内攻毒的功能性无菌保护，SeV载体有望成为诱导呼吸道黏膜免疫、阻断病毒传播的重要疫苗平台。